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PCR múltiple para la detección simultánea de microorganismos patógenos para la T
Abstract
Se ha desarrollado un ensayo de PCR múltiple (m-PCR), para la detección simultánea de tres bacterias que originan enfermedades en la trucha (Yersinia ruckeri, Streptococcus iniae y Lactococcus garvieae). Cada una de las tres parejas de oligonucleótidos utilizadas como iniciadores en la reacción de PCR múltiple, amplificaba el gen de interés de cada uno de los microorganismos. Sin embargo, los iniciadores utilizados para la detección de S. iniae resultaron poco específicos, al amplificar un fragmento de igual tamaño a partir del ADN de Streptococcus agalactiae y Streptococcus difficilis.
Estos resultados, hacen necesario la búsqueda de un método de PCR alternativo para el diagnóstico de las infecciones producidas por S. iniae.
Introducción
En términos de producción, las enfermedades infecciosas siguen siendo la causa
mayoritaria de las pérdidas económicas en Acuicultura debido a la mortalidad de animales,
los costes de tratamiento y el descenso de producción. Así, las pérdidas debidas sólo a la
mortalidad de los peces por enfermedades infecciosas se estiman en un 10%, causando
algunas de estas enfermedades mortalidades superiores al 90%. Dentro de las
enfermedades que más afectan al cultivo de la trucha en los países del área mediterránea,
destacan las infecciones por Yersinia ruckeri, Lactococcus garvieae y Streptococcus iniae.
Y. ruckeri es el agente etiológico de la enfermedad de la boca roja o yersiniosis. A pesar de
la existencia de una vacuna comercial, la yersiniosis sigue siendo una enfermedad
importante por su alta prevalencia entre los salmónidos, debido fundamentalmente a la
existencia de animales portadores, a la supervivencia del microorganismo en el medio
ambiente, que origina brotes recurrentes de la enfermedad (1) y a la aparición de nuevos
serovares patógenos (2). L. garvieae fue descrito como patógeno de peces por primera vez
en Japón (3) y en la actualidad constituye uno de los patógenos de peces más importantes
en todo el mundo, capaz de infectar tanto especies continentales como la trucha, donde
origina pérdidas de más del 10% de los peces (4), como a especies marinas, tales como la
anguila, el pez limón y algunos múlidos (3 y 5). S. iniae afecta a más de 22 especies de
peces marinos y continentales, entre los que se incluyen la tilapia, el pez gato, la dorada y
la trucha (6 y 7). Las pérdidas económicas causadas por este patógeno en la acuicultura
mundial se han estimado en más de 100 millones de dólares al año (7).
El diagnóstico laboratorial de estas enfermedades normalmente se realiza mediante el
aislamiento del patógeno a partir de los peces enfermos y su posterior identificación
bioquímica. Sin embargo, este procedimiento puede resultar problemático: en el caso de
Y. ruckeri y L. garvieae, por presentar diversidad de perfiles bioquímicos, a veces
compatibles con otras especies (8 y 9), en el caso de y S. iniae por no estar contemplado en las bases de datos de los sistemas comerciales (10). Los métodos de diagnóstico
basados en la PCR resultan una alternativa eficaz a los métodos de identificación
bioquímica.
Aunque existen ensayos de PCR para la detección de muchos
microorganismos patógenos de interés en acuicultura (11), incluidos Y. ruckeri (12), S. iniae
(13) y L. garvieae (14), el diagnóstico mediante PCR de forma individual de cada uno de
ellos puede resultar costoso y lento. Por este motivo, en nuestro laboratorio estamos
desarrollando ensayos de PCR múltiple para la detección simultánea de bacterias que
tienen importancia en acuicultura. En este trabajo se describe la detección simultánea por
PCR de L. garvieae, S. iniae y Y. ruckeri.
Material y métodos
Microorganismos y Condiciones de cultivo.
Las cepas de colección utilizadas en este estudio como controles positivos de PCR fueron
S. iniae ATCC 29178T, ATCC 29177 y S. iniae (S. shiloi) CIP 103769T, L. garvieae ATCC
43921T, CECT 894T y Y. ruckeri CECT 955 y CECT 956. Los aislados clínicos de L. garvieae y Y. ruckeri proceden de peces enfermos de lactococosis y yersiniosis, diagnosticados en nuestro laboratorio (Tabla I).
Los aislados clínicos de S. iniae procedentes de peces enfermos han sido amablemente
cedidos por los Doctores J. Black y J. Birrel, del FRS Marine Laboratory (Aberdeen,
Escocia). Las cepas de S. iniae procedentes de casos clínicos humanos fueron cedidos por
las Doctoras J.C. de Azavedo, del Department of Laboratory Medicine and Pathobiology of
the University of Toronto (Ontario, Canadá) y S. Lau, del Department of Microbiology of the
University of Hong Kong (China). Las cepas de L. garvieae aisladas de casos clínicos en
humanos fueron cedidas por la Dra. L.M. Texeira del Instituto de Microbiología de la
Universidad federal de Río de Janeiro. Todas las bacterias se hicieron crecer sobre medios
sólidos de Columbia sangre (bioMérieux España S.A.), incubándose a 30ºC o 22ºC, de
acuerdo con las características propias de cada bacteria.
La identificación bioquímica de los aislados clínicos se realizó con los sistemas comerciales
API 20E y Rapid ID 32 STREP system (bioMérieux España, S.A.)
Aislamiento de ADN bacteriano y amplificación por PCR
El ADN cromosómico de las bacterias utilizadas en los ensayos de PCR fue purificado
mediante extracción con fenol/cloroformo (12). Los oligonucleótidos utilizados como
iniciadores en la amplificación específica de cada microorganismo, así como el tamaño de
los amplicones esperados en cada caso, se especifican en la Tabla II.
La reacción de PCR multiple fue optimizada para la detección simultánea de Y. ruckeri,
L. garvieae y S. iniae utilizando diversas cantidades de MgCl2, iniciadores, dNTPs y Taq
polimerasa (Biotools). El programa de PCR multiple utilizado consistió en un paso inicial de
desnaturalización a 94ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 92ºC
durante 1 min, “annealing” a 55ºC durante 1 min y extensión a 72ºC durante 1 min 30 s
seguidos de un paso de extensión final a 72ºC durante 5 min. En cada ensayo de PCR se
incluyeron controles negativos y positivos (50 ng of DNA purificado de cada organismo). Las
amplificaciones se realizaron en un Termociclador PT-100 thermal cycler (MJ Research,
Inc.).
Los productos de PCR generados en cada reacción, se visualizaron por electroforesis
en geles de agarosa al 2% en 1% de Tris-Acetato-EDTA, teñidos con bromuro de etidio
(0.5 mg/ml).
Especificidad de los iniciadores utilizados en la m-PCR
Cada pareja de iniciadores fue analizada por su especificidad en la amplificación de los
microorganismos deseados, mediante la utilización en los ensayos de PCR múltiple, de
combinaciones distintas con el ADN purificado de todas las bacterias que figuran en la
Tabla I.
Resultados
Las reacciones óptimas de PCR múltiples se obtuvieron utilizando en la mezcla de reacción
1x: 1.5 mM de MgCl2, 0.25mM de DNTPs, 1 µM de cada uno de los iniciadores y 1.5 U Taq
polimerasa. Tal y como se aprecia en la Figura 1, se ha conseguido la amplificación
simultánea de los tres microorganismos: Y. ruckeri, S. iniae y L. garvieae. Además, los
datos obtenidos en relación a la sensibilidad de este ensayo de m-PCR han sido de 30 UFC
para L. garvieae, 65 UFC para Y. ruckeri y 250 UFC para S. iniae, comparables a los
descritos en las PCRs individuales para cada microorganismo (12 y 14).
Respecto a la especificidad de esta m-PCR, se pudo observar que la reacción de
amplificación fue totalmente específica en relación con las bacterias de la Tabla I, con la
excepción de Streptococcus difficilis y/o Streptococcus agalactiae para los que se obtenía la
amplificación de un fragmento de igual tamaño (300 pb), que el esperado para S. iniae. Por
este motivo, los iniciadores utilizados para la amplificación específica de S. iniae (18), se
ensayaron en reacciones de PCR simples con cada uno de los ADNs aislados de las
bacterias de la Tabla I.
Tal y como se observa en la Figura 2, los iniciadores descritos por
Zlotkin y colaboradores (13), basados en el gen que codifica el ARN ribosómico 16S
(16S rRNA) de S. iniae, amplificaban S. difficilis y Streptococcus agalactiae.
Resultados y discusión
El desarrollo de una PCR múltiple para la detección simultánea de Y. ruckeri, L. garvieae y
S. iniae presenta un importante interés para el diagnóstico de las enfermedades producidas
por estos patógenos en las piscifactorías de trucha y salmónidos. No obstante, la falta de
especificidad observada para la amplificación con los iniciadores basados en el gen del 16S
rRNA de S. iniae (13), puede resultar especialmente importante en el diagnóstico
ictiopatológico, si consideramos que S. difficilis es patógeno para las truchas (15) y que
puede aislarse simultáneamente con S. iniae (16). Esta falta de especificidad observada en
la amplificación de S. difficilis y S. agalactiae con los iniciadores diseñados para S. iniae,
nos ha llevado a la necesidad de diseñar en nuestro laboratorio, un nuevo ensayo de PCR
específico para la amplificación de S. iniae.
Por otra parte, tanto L. garvieae como S. iniae han sido relacionados con diversas
infecciones en el hombre tales como osteomielitis, endocarditis, celulitis, y procesos septicémicos (10 y 17). Por tanto, una vez solucionados los problemas de especificidad de
S. iniae, la m-PCR podría ser útil en el diagnóstico y/o identificación de estas bacterias a
partir de muestras clínicas humanas.
Agradecimientos
El equipo investigador de este trabajo quiere agradecer la donación de cepas clínicas de
S. iniae y L. garvieae, procedentes de casos clínicos en humanos, a las Dras. J. Black,
J. Birrel, J. de Azavedo, S. Lau y L.M. Texeira. Las cepas clínicas de Streptococcus
agalactiae han sido cedidas por Elena Fernández.
Este trabajo ha sido económicamente financiado a través de un Proyecto de Investigación
ACU00-004-C2-2 del Ministerio Español de Ciencia y Tecnología.
Referencias
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EJE CONCEPTUAL DEL ARTICULO
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PCR múltiple para la detección simultánea de microorganismos patógenos para la Trucha Arco Iris en el área mediterránea | Introducción
Las enfermedades infecciosas siguen siendo la mayor causa las pérdidas económicas en Acuicultura debido a la mortalidad de peces. Dentro de las enfermedades que más afectan al cultivo de la trucha en los países del área mediterránea, destacan las infecciones por Yersinia ruckeri, Lactococcus garvieae y Streptococcus iniae. Siendo la yersiniosis una enfermedad importante por su alta prevalencia entre los salmónidos.
El diagnóstico se realiza mediante el aislamiento del patógeno a partir de los peces enfermos y su posterior identificación bioquímica. Los métodos de diagnóstico basados en la PCR múltiple resultan una alternativa eficaz para la detección simultánea de bacterias que tienen importancia en acuicultura.
Material y métodos
.Microorganismos y Condiciones de cultivo
.Aislamiento de ADN bacteriano y amplificación por PCR
.Especificidad de los iniciadores utilizados en la m-PCR
Resultados
Se pudo observar que la reacción de amplificación fue totalmente específica en relación a ciertas bacterias, a excepción de Streptococcus difficilis y/o Streptococcus agalactiae. Por este motivo, los iniciadores utilizados para la amplificación específica de S. iniae se ensayaron en reacciones de PCR simples con cada uno de los ADNs aislados de las bacterias.
Conclusión
El desarrollo de una PCR múltiple para la detección simultánea de Y. ruckeri, L. garvieae y
S. iniae presenta un importante interés para el diagnóstico de las enfermedades de truchas y salmónidos; sin embargo existe una inespecificidad observada en ciertas amplificaciones genéticas, lo cual ha generado la necesidad de diseñar un nuevo ensayo de PCR específico para la amplificación de S. Iniae.
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| "PCR múltiple para la detección simultánea de microorganismos patógenos para la T"
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Re: Novedades de Syntex S.A.
por Anonymous el 26 de Marzo de 2003 | | En la publicidad no se lee el principio activo del producto, lo correcto para un producto que se va a introducir nuevo al mercado es que se de detalles más precisos de él, y no conformarse con dar sólo el nombre, ok. |
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