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¹Felicitat Todolí Simó, Alhelí Rodríguez-Cortés, Jordi Alberola Domingo, ²Laia Solano-Gallego.
¹ LeishLAB. Departament de Farmacologia, Terapèutica i Toxicologia Veterinària, Facultat de Veterinària, Universitat Autònoma de Barcelona.
²Department of Pathology and Infectious Diseases, Royal Veterinary College, University of London.
Imágenes cedidas por los autores

En los últimos años se han conseguido grandes avances en este campo y prueba de ello son las vacunas con elevados grados de protección en fase III y otras prometedoras aún en fase II. Es de esperar que en un futuro no muy lejano podamos disponer de una vacuna eficaz contra Leishmania en perros.
El desarrollo de una vacuna eficaz contra la leishmaniosis canina sigue siendo un objetivo complejo y difícil de alcanzar. Tras décadas de investigaciones, la primera vacuna contra esta enfermedad en perros ha sido comercializada (Leishmune), y otra ha obtenido ya el registro sanitario (Leishtec), ambas en Brasil. En Francia, además, existe otra vacuna en desarrollo con elevados grados de protección en estudios de campo. Es posible que en un futuro no muy lejano podamos disponer de una vacuna eficaz contra esta enfermedad olvidada por las autoridades sanitarias a pesar de su incidencia en humanos (700 casos anuales en el sur de Europa) y de su carácter zoonótico.

La infección en el perro

La leishmaniosis humana es la tercera enfermedad transmitida por vectores más importante en el mundo, después de la malaria y la filariosis. El perro juega un importante papel como reservorio en la forma visceral zoonótica causada por Leishmania infantum y entre un 5%-10% de la población canina residente en zonas endémicas desarrolla la enfermedad. Las manifestaciones clínicas de la leishmaniosis pueden aparecer en el perro infectado desde varios meses a varios años después de la infección. La gran diversidad de cuadros clínicos que pueden llegar a presentar los perros infectados es debida a los numerosos mecanismos patogénicos causados por Leishmania y a las diferentes respuestas inmunitarias que pueden desarrollar los animales. Diferentes estudios demuestran que, mientras la prevalencia de enfermedad en la cuenca Mediterránea estaría alrededor del 5%-10% como se comentaba anteriormente, el porcentaje de perros que desarrollan anticuerpos anti-Leishmania sería más alto, del 10%-37%, y la verdadera tasa de infección aún superaría estos valores, alcanzando el 65%-80% (estudios que evalúan la respuesta celular, o bien que utilizan PCR sobre diferentes tejidos). Por lo tanto, en la leishmaniosis canina, el concepto de infección no es sinónimo de enfermedad. Es decir, no todos los perros infectados por Leishmania desarrollarán signos clínicos o alteraciones clinicopatológicas. Este hecho es debido a que la respuesta inmunitaria en el perro infectado con eishmania es una compleja combinación de dos tipos de respuestas, celular y humoral, que dan lugar a un amplio rango de situaciones: en uno de los polos encontraríamos los perros enfermos o susceptibles con respuesta humoral exagerada (respuesta Th2) y, en el otro, a los perros infectados pero clínicamente sanos o resistentes con respuesta predominantemente de tipo celular (respuesta Th1), acompañada o no de producción de anticuerpos. En la cuenca Mediterránea encontramos que la mayoría de la población canina ha tenido contacto con el parásito y, aunque infectada, desarrolla una respuesta inmune capaz de controlar la enfermedad. Por el momento, se desconocen las implicaciones epidemiológicas de este gran número de perros infectados. Los perros clínicamente sanos pueden representar hasta el 60% del total de perros infectados y, aunque en menor medida que los enfermos, también son infectivos para el vector flebotomo. Sin embargo, el grado de infectividad de un perro se encuentra correlacionado con el nivel de IgG anti-Leishmania específicas producidas. Este hecho es debido a que los perros con leishmaniosis clínica presentan mayores cargas parasitarias en diferentes tejidos como, por ejemplo, la piel en comparación con los perros infectados clínicamente sanos. Estas altas cargas parasitarias activan fuertemente al sistema inmunitario, dando lugar a una producción elevada de IgG específica. Por tanto, el perro enfermo o seropositivo alto será el principal objetivo de cualquier medida de control de esta parasitosis.

La mayoría de los métodos disponibles actualmente para el tratamiento y control de la enfermedad presentan una eficacia limitada. Estudios recientes en Irán demuestran que el control de la infección en perros disminuye su capacidad infectiva y la incidencia de la enfermedad en niños. Por esta razón, la vacunación de los perros constituiría la medida más eficaz para el control de la leishmaniosis visceral, tanto en la población canina como en la humana. La característica principal que ha de cumplir toda vacuna es mimetizar los efectos de una exposición al patógeno, de manera que consiga desarrollar en el animal vacunado un tipo de inmunidad que lo proteja frente a una infección natural posterior. En el caso de la leishmaniosis se requerirá que la vacuna estimule principalmente una respuesta inmunitaria celular (Th1), que es la que presentan de forma natural los perros resistentes y que genere memoria a largo plazo. Sin embargo, pese a los múltiples estudios realizados durante décadas, actualmente sólo existe una vacuna comercializada para la prevención de la leishmaniosis canina: Leishmune, en Brasil. Este problema no es exclusivo de Leishmania, sino que afecta al desarrollo de vacunas diseñadas contra todo tipo de infecciones parasitarias. De hecho, la inmunización contra este grupo de enfermedades continúa siendo un desafío y, por el momento, muy pocas vacunas se hallan comercializadas. Hay diversas razones que explican esta dificultad:

• Las infecciones parasitarias, a diferencia de las causadas por bacterias o virus, tienden a ser crónicas en la naturaleza. Esto es debido principalmente a que los parásitos provocan a menudo respuestas inmunitarias ineficaces en el huésped, previniendo su eliminación y prolongando la infección en el tiempo. Éste sería el caso de la inducción de una respuesta humoral exagerada no protectora en la infección por Leishmania.
• Los parásitos desarrollan con frecuencia estrategias de evasión de la respuesta inmune. En la infección por Leishmania son destacables la supresión de los mecanismos leishmanicidas en el interior del macrófago, la inhibición de la presentación de antígenos o la infección de células sin capacidad leishmanicida.
• Los parásitos presentan ciclos biológicos más complejos que las bacterias o los virus, con diferentes fases biológicas que complican el desarrollo de una vacuna. Leishmania presenta dos fases en su ciclo biológico: la fase de amastigote en el interior del hospedador vertebrado y la de promastigote en el hospedador invertebrado.

A pesar de estas dificultades, existen casos en que las infecciones parasitarias confieren en el huésped inmunidad frente a reinfecciones por el mismo parásito. En el caso de la infección por Leishmania, la existencia de una población de perros infectados que desarrolla de manera natural una respuesta inmunitaria protectora de control del parásito indica que es posible forzar una respuesta inmunitaria eficaz mediante una vacuna. El desarrollo de dicha vacuna ha de seguir diferentes fases. Los ensayos clínicos de fase I evalúan la seguridad y la capacidad de la vacuna para activar una correcta respuesta inmunitaria comparando individuos vacunados con individuos controles. El siguiente paso son los ensayos de fase II que evalúan la protección inducida por la vacuna ante una infección experimental. Aunque se consideran necesarios, su utilidad es relativa puesto que la infección experimental con Leishmania en perro no consigue mimetizar la infección de tipo natural y son varios los factores que afectan al resultado final, como son la dosis, la vía de inoculación y la fase del parásito. Finalmente, los ensayos de fase III evalúan la eficacia de la vacuna en condiciones naturales: son los llamados estudios de campo. Si la vacuna supera con éxito estas tres fases puede registrarse y comercializarse. Tras su comercialización, la vacuna entra en fase IV o farmacovigilancia, en que se realiza un seguimiento de la misma en las condiciones habituales de uso. Las vacunas probadas contra la leishmaniosis canina pueden dividirse en tres grupos: las de primera generación, consistentes en parásito muerto, vivo, atenuado o modificado genéticamente; las de segunda generación, compuestas por proteínas del parásito ya sean purificadas o recombinantes y, por último, las de tercera generación o vacunas de ADN, compuestas por vectores que contienen genes que codifican antígenos del parásito. Recientemente se están utilizando estrategias para mejorar la eficacia de las vacunas de ADN como el sistema de vacunación-revacunación heteróloga, que consiste en la vacunación con ADN y la revacunación con el mismo epítopo pero en vectores o formulaciones diferentes, por ejemplo un virus o una proteína recombinante.

Por el momento, dos vacunas contra la leishmaniosis canina han obtenido resultados prometedores en los ensayos de fase III: Leishmune, registrada y comercializada en Brasil y en fase de registro en Europa, y LiESAp-MDP (LiESAp: Leishmania infantum excreted secreted antigens from promastigotes), desarrollada en Francia. Sobre la vacuna registrada este mismo año en Brasil, LeishTec, no hay todavía datos publicados.

Curiosamente, estas dos vacunas pertenecen al mismo grupo, las llamadas vacunas de segunda generación, es decir, están formuladas con fracciones purificadas del parásito. Es posible que la eficacia de dichas vacunas recaiga en el hecho de que contienen más de un antígeno del parásito y que están formuladas con fuertes adyuvantes que estimulan la respuesta inmunitaria innata, no sólo la adquirida. La eficacia de la vacunación se ha analizado en estos estudios de dos maneras: la eficacia contra la infección, que evalúa el grado de protección que confiere la vacuna frente a que el animal se infecte, y la eficacia contra la enfermedad, que estudia el grado de protección contra el desarrollo de síntomas clínicos.

Como se ha mencionado, Leishmune fue la primera vacuna comercializada contra la leishmaniosis canina. Consiste en una fracción purificada de Leishmania donovani, el ligando fucosa-manosa (FML), cuyo principal componente es la hidrolasa de nucleósidos, NH36. Éste es un enzima crítico en el inicio de la infección por Leishmania, ya que fragmenta nucleósidos y libera bases púricas que el parásito necesita para la síntesis de ADN y la multiplicación en el huésped. Dos ensayos de fase III en Brasil avalan la utilidad de esta vacuna sola o con un adyuvante (QuilA) en la prevención de la leishmaniosis canina [1, 2]. El grado de protección contra la enfermedad se situó entre el 75%-80%. Es decir, mientras que entre el 25%-33% de los perros del grupo control desarrolló síntomas clínicos de leishmaniosis, sólo entre el 5%-8% del grupo vacunado enfermó. La vacunación indujo respuesta humoral en la totalidad de los perros y respuesta celular específica en el 94% de ellos. El grado de protección contra la infección ha sido evaluado más recientemente y se situó alrededor del 100%. Otro hecho destacable de esta vacuna es que actúa como bloqueante de la transmisión. Este concepto se utilizó por primera vez para describir las vacunas contra la malaria que impiden el desarrollo de la fase infectiva en el vector Anopheles. Cuando el mosquito pica al huésped inmunizado con este tipo de vacunas, los anticuerpos generados por el huésped son ingeridos por el mosquito, de forma que se bloquea el proceso de reproducción de los parásitos y se incapacita al vector para transmitir la malaria. Este efecto bloqueante ha sido demostrado recientemente en los flebotomos alimentados con amastigotes y suero de perros vacunados con FML [3], señalando que esta vacuna puede interrumpir el ciclo epidemiológico de Leishmania. A pesar de todos estos resultados, para que sea posible la comercialización de esta vacuna en Europa será necesario demostrar su eficacia contra una infección experimental con L. Infantum y llevar a cabo un estudio de campo en centros europeos.

La segunda vacuna con interesantes resultados en fase III es la desarrollada en Francia con antígeno excretado y secretado obtenido a partir del sobrenadante de cultivos de promastigotes de L. infantum y posteriormente purificado [4]. La vacuna se administra junto con el adyuvante muramil dipéptido (MDP). La protección inducida por esta vacuna se ha correlacionado con el establecimiento de una correcta respuesta inmunitaria temprana y prolongada frente a Leishmania. En los perros vacunados, y únicamente en este grupo, se detectó una activación junto con un aumento de la capacidad leishmanicida de los macrófagos a través de linfocitos T. En la fase III del ensayo clínico, el 2,7% de los perros controles desarrolló signos de enfermedad mientras que ningún animal del grupo vacunado enfermó. En cuanto a la tasa de infección, fue del 0,6% en los perros vacunados y del 6,8% en los perros controles, es decir, 11 veces inferior en el grupo inmunizado. De esta manera, la eficacia de esta vacuna contra la infección por Leishmania en perros fue del 90%.

Nuestro grupo de trabajo lleva varios años investigando en el campo de las vacunas conocidas como de tercera generación. Este tipo de vacunas, al ser de desarrollo más reciente, todavía no ha sido testado en estudios de fase III. En el año 2002, nuestro grupo presentó la primera vacuna de ADN diseñada contra la leishmaniosis canina. Los resultados de dicho estudio preliminar indicaban que este tipo de inmunización activaba una correcta respuesta inmunitaria específica contra el parásito en el perro. A partir de estos resultados, se inició un mayor estudio publicado recientemente [5], el cual demuestra que, a pesar de dicha respuesta inmunitaria y cierto control de la infección, este tipo de vacunas necesitan ser mejoradas. Para potenciar el efecto de la vacunación con ADN, en el Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid, científicos españoles en colaboración con la Universidad de Zaragoza y el Centro Nacional de Biotecnología, han desarrollado una vacuna consistente en la vacunación con ADN que codifica para un gen de L. infantum (LACK) junto con una revacunación utilizando un virus que expresa el mismo gen. Los primeros resultados de eficacia de la vacuna contra la infección experimental han sido muy positivos [6] y, actualmente, se están desarrollando nuevos vectores más seguros que el virus revacunal utilizado en dicho estudio [7]. Siguiendo esta línea nuestro grupo ha desarrollado una vacunación contra la leishmaniosis consistente en ADN más proteína producida en larvas de insecto que, actualmente, está siendo ensayada en fase II en el modelo de hámster. Futuros estudios de fase III serán necesarios para evaluar la eficacia de este tipo de vacunación frente a la infección natural.

“Las vacunas de Leishmania van ya por la proteómica”

Los parásitos son mosaicos antigénicos, es decir, tienen cientos de receptores antigénicos que se dividen en: superficie, metabólicos y somáticos. Inicialmente, se pensó que eran los antígenos de superficie los que conferirían respuesta protectora. Se intentó con parásitos muertos, modificados... Al ver que no funcionaba, después se probó con antígenos totales (lisando el parásito). Tampoco funcionó, aparentemente debido a que muchos de los antígenos presentan una disposición tridimensional que, a veces, no los hace aptos para las células presentadoras de antígeno. Se empezaron a extraer y caracterizar proteínas con capacidad inmunogénica y, a partir de aquí, llegaron otras vacunas (GP63...), que tampoco funcionaron. Lo que se ha hecho después es secuenciar estas proteínas que tienen capacidad inmunogénica para obtener los genes que inducen su producción. Se ha visto que el ADN en plásmido no tiene capacidad inmunogénica suficiente para activar la RI celular en el hospedador. Sin embargo, si se introduce el ADN en vectores o lanzaderas (virus modificados u otros sistemas más avanzados que no son virus verdaderos y evitan los riesgos de trabajar con éstos), se aumenta la RI frente a esa proteína. En esto se está trabajando actualmente. Como los virus son todos intracelulares, teóricamente son captados por las células macrofágicas y, sobre todo, las células presentadoras de antígenos (células dendríticas). La explicación del fallo reside en la manera en que las células dendríticas expresan ese antígeno una vez lo han fagocitado. Por otro lado, hay una serie de bloqueos del parásito sobre ciertos mecanismos (evasión de la respuesta inmune) y que estos antígenos no tienen la suficiente capacidad inmunogénica frente a la RI celular. Lo que se ha intentado es aumentar esta baja inmunogenicidad con adyuvantes naturales (plantas, sales de aluminio...) o interleucinas (especialmente el g-interferón y la Il-10), tratando de activar de forma inespecífica la inmunidad natural. El objetivo actual Nuestro grupo ya hace años que utilizó el antígeno LACK, una molécula que siendo intracelular podía desarrollar una respuesta inmune protectora en un 70-80% de los casos, frente a una infección experimental un millón de veces superior a la natural. En esto momentos, y a la espera de los resultados de un experimento de fase II, hay que dar un paso más en la obtención de una vacuna efectiva. Para ello, nuestro grupo está avanzando en dos frentes. Por una parte, sabemos qué tipos celulares están implicados en las primeras fases del establecimiento de la RI en los perros protegidos por la vacuna. Se está estudiando en estos momentos qué genes se encuentran activados en las células de estos perros que no lo están en las procedentes de perros enfermos. Lo ideal sería encontrar algún receptor relacionado con el establecimiento de la RI protectora. Por otra parte, se ha obtenido una genoteca completa de Leishmania infantum que además se ha ordenado en microarrays, lo que nos permitirá encontrar el gen o genes (y las proteínas consiguientes) del parásito que estén relacionados con la presentación de antígeno (por las células dendríticas o macrófagos) que origina la RI protectora en los perros. La obtención de estos microarrays conteniendo 30.000 clones con el genoma completo del parásito no ha sido fácil, pero es la mejor manera de localizar los antígenos responsables de la protección. No está clara la causa de por qué las otras vacunas están fallando, pero puede ser debido a que el mecanismo de reconocimiento del antígeno por el perro es mucho más sensible de lo que se cree. De hecho, un mismo antígeno produce diferente respuesta según la vía de inoculación (o, lo que es lo mismo, según el tipo de presentación al sistema). Una vez localizados los antígenos responsables de la protección, la obtención de una vacuna más efectiva y segura será un objetivo factible a corto plazo. 1Juan Antonio Castillo, 2Vicente Larraga 1Facultad de Veterinaria de Zaragoza, 2Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC

Bibliografía disponible en www.argos.grupoasis.com/bibliografias/leishmaniosis101.doc