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PCR y leishmaniosis canina



GUADALUPE MIRÓ y XAVIER ROURA

Guadalupe Miró es Prof. Titular Dpto. Sanidad Animal. Responsable Consulta de Patología Infecciosa y Parasitaria HCV (UCM). Presidenta de LeishVet.

Xavier Roura es DVM, Phd, Diplomado ECVIM-CA. Hospital Clínic Veterinari UAB. Miembro del Grupo de Estudio de la Leishmaniosis Canina (GSLC) de la SCIVAC (Italia).
Sheila Riera. Argos
argos@grupoasis.com
Imágenes archivo


El diagnóstico de la leishmaniosis canina es objeto de controversia desde hace tiempo, concretamente en lo que se refiere a la utilización de la serología y de la PCR. Dos reconocidos expertos en la materia, Guadalupe Miró y Xavier Roura, nos aclaran en la siguiente entrevista algunas dudas planteadas habitualmente por los clínicos.

¿Qué consideraciones se deben tener en cuenta en la toma de muestras para enviar al laboratorio?
Guadalupe Miró.
Las muestras biológicas para enviar al laboratorio dependerán de cada caso en cuestión. En principio, con muestras de sangre para realizar las determinaciones habituales y la serología sería suficiente.
En segundo lugar, si vamos a realizar PCR se puede hacer a partir de diferentes muestras pero la sensibilidad no es la misma. Así, y por este orden, la muestra ideal sería la médula ósea, seguida de linfonodo, piel (si hay lesiones) y sangre (la menos sensible). Así mismo, podemos enviar otras muestras como: bazo, líquido articular, líquido cefalorraquídeo, etc. en casos más complejos.

Xavier Roura. La elección de la muestra para el diagnóstico o seguimiento de un perro con leishmaniosis es de carácter clínico. El veterinario debe decidir en cada caso cuál es la muestra clínica más eficaz, ya que debido al tropismo variado que exhibe el parásito frente a los distintos tejidos, la cantidad de parásito es diferente y oscila. Por ejemplo, la carga parasitaria puede ser de 4.000 a 5.000 veces mayor en un aspirado de médula ósea que en sangre periférica. Debido a esto, el veterinario debe variar el tipo de muestra en función de cada caso y de lo que quiera evaluar en esa PCR. Si lo que se quiere es hacer un diagnóstico, hay que seleccionar la muestra clínica donde creamos que vamos a encontrar más parásitos. Si el cuadro clínico es marcadamente cutáneo o muco-cutáneo (nódulos, pápulas, úlceras, fístulas, alopecias con descamación, hipopigmentación, etc.) las mejores muestras serían las biopsias de estas lesiones o el aspirado de médula ósea, por este orden. Si el cuadro clínico es más heterogéneo, probablemente el aspirado de médula ósea, la sangre periférica o el aspirado de ganglio, por este orden, podrían ser las muestras clínicas de elección. Algunos veterinarios realizan una mezcla de sangre y aspirado de médula ósea (muchas veces se obtiene poca cantidad) como muestra para realizar la PCR, ya que de esta manera aumentan las posibilidades de detección del parásito.
Como los cuadros clínicos asociados a la leishmaniosis son tan variados, en los casos en los que las lesiones estén circunscritas sólo a mucosas, ojos, articulaciones, hueso, intestino, músculo, tejido subcutáneo, uñas, etc., las biopsias de cada una de estas lesiones serán las mejores muestras clínicas para realizar la PCR. Sin embargo, la habilidad de la qPCR (real-time PCR) de cuantificar cargas parasitarias muy bajas permite a su vez utilizar la sangre periférica (debido a su fácil obtención) como muestra válida tanto para el diagnóstico de la leishmaniosis en muchos de los casos como para el seguimiento durante el tratamiento. Si se ha enviado una muestra de sangre periférica para el diagnóstico de la leishmaniosis mediante PCR y el resultado ha sido negativo, y seguimos pensando que el cuadro clínico es muy sugestivo de leishmaniosis, se debe enviar otra muestra de aspirado de médula ósea solo o mezclado con sangre periférica para aumentar las posibilidades de detección del parásito.

¿Qué metodología diagnóstica laboratorial recomienda para el diagnóstico y el seguimiento de la enfermedad?
G. M. En primer lugar habría que puntualizar que el término leishmaniosis canina lo emplearemos para hablar de perros que padecen la “enfermedad” y que emplearemos el término “infección” para referirnos a perros clínicamente sanos que están infectados pero no han desarrollado signos clínicos ni alteraciones clínico-patológicas. Este grupo es mucho mayor en zonas endémicas (más del 50%) que el de los perros enfermos (5-10%).
Una vez aceptado esto tendremos que definir si lo que diagnosticamos es una infección por Leishmania infantum o una leishmaniosis clínica.
La interpretación del diagnóstico es lo más complejo, requiere evaluar los resultados obtenidos de todas las pruebas realizadas y actuar en consecuencia.
En el ámbito de la investigación puede tener mucho interés conocer los casos de perros infectados clínicamente sanos en determinadas áreas para realizar estudios epidemiológicos de distinta índole, pero en la clínica diaria lo que interesa es diagnosticar bien los perros enfermos con el fin de instaurar el tratamiento adecuado lo antes posible.
El diagnóstico de la leishmaniosis canina debe incluir una buena anamnesis (la historia clínica es fundamental), un examen físico exhaustivo y una serie de pruebas laboratoriales tanto específicas como inespecíficas.
Podemos realizar un primer acercamiento para conocer el estado general de nuestro paciente realizando un hemograma, perfil bioquímico hepatorrenal, urianálisis y proteinograma para definir correctamente las posibles alteraciones clínico-patológicas encontradas.

X. R. El diagnóstico y el seguimiento de la leishmaniosis canina se deben basar en un protocolo integrado que considere la reseña, la historia clínica, los signos clínicos y los resultados de las pruebas que detectan el parásito o evalúan la respuesta inmunitaria del paciente.
Como regla general, la leishmaniosis canina puede ser confirmada de forma rápida y eficaz mediante citología, serología o PCR en perros con signos clínicos evidentes o alteraciones analíticas graves. Sin embargo, esto no siempre es posible en los perros que viven en áreas endémicas que se visitan frecuentemente y que tienen signos clínicos vagos o muy iniciales de la enfermedad. El principal problema radica en demostrar la relación causa-efecto, es decir Leishmania-enfermedad, mediante la confirmación directa o indirecta del parásito. Sin esta confirmación, existe el riesgo de sobrestimar la leishmaniosis canina. En perros con signos clínicos, la primera línea de diagnóstico es la demostración del parásito mediante citología/biopsia y la serología. Según los resultados obtenidos, la utilización de la PCR es necesaria. Si la citología o la biopsia son negativas, sólo si la serología tiene un título alto (4 veces el valor de normalidad de cada laboratorio) se puede realizar un diagnóstico de leishmaniosis canina. En este punto es donde la PCR puede ayudar en el diagnóstico tanto en las biopsias como en otras muestras (médula ósea, ganglio linfático, sangre, raspados conjuntivales, etc.). En los perros con signos clínicos sistémicos sugestivos de leishmaniosis, la PCR de médula ósea, sangre o ganglio linfático es adecuada para la detección del parásito.
Si la PCR es negativa, estos perros “citología negativa-positivo bajo en la serología” deben considerarse libres de Leishmania (tuvo un contacto anterior) o infectados de Leishmania pero subclínicos y el cuadro clínico actual está asociado a otra enfermedad diferente de la leishmaniosis. En estas dos situaciones la evaluación periódica del título de anticuerpos (se espera que con el tiempo se incremente) y/o la realización de la PCR pueden ser de ayuda.
El seguimiento de los perros infectados con Leishmania con o sin tratamiento, se ha de realizar según cada caso. En general, si el perro sólo está con tratamiento de leishmaniosis sin ninguna otra terapia de soporte, parece adecuado un control al final del tratamiento parasiticida que consistirá en examen físico y control básico bioquímico/urinario. Si los resultados están dentro de la normalidad o en vías de normalización, hay que continuar con el alopurinol. Se deben realizar controles cada 6-8 meses con examen físico, bioquímica/urianálisis, determinación del título de anticuerpos y evaluación de la carga parasitaria en los perros infectados con Leishmania.
Evidentemente cada caso es diferente y se debe evaluar la situación clínica del paciente y la predisposición/capacidad económica del propietario para decidir el protocolo exacto. Según los resultados, si es necesario, iniciar o reiniciar el tratamiento de la leishmaniosis con el mismo tratamiento o buscar protocolos alternativos. En los perros con alteración de la funcionalidad renal, se debe hacer un control de seguimiento a los 7-10 días. Al final del tratamiento, hay que monitorizar el paciente mucho más frecuentemente (cada 1-2 meses) respecto a lo descrito anteriormente, y dar mayor importancia a las alteraciones de la funcionalidad orgánica.

¿Es cierto que la serología, por sí sola, puede dar lugar a diagnósticos de infección por Leishmania erróneos?
G. M.
La detección de anticuerpos anti-Leishmania es siempre necesaria en el protocolo de diagnóstico de leishmaniosis canina. Los métodos cualitativos (test rápidos basados en técnicas inmunocromatográficas) pueden ser útiles para un primer screening, pero en los casos positivos debe realizarse siempre una cuantificación de los niveles de anticuerpos mediante técnicas de IFI o ELISA en laboratorios especializados. Los resultados obtenidos en la serología deben siempre asociarse al resto de los resultados obtenidos (signos clínicos, alteraciones clínico-patológicas, detección del parásito). Animales clínicamente sanos (tanto en el examen físico como en las pruebas laboratoriales) con niveles bajos de anticuerpos deben considerarse animales dudosos. Si se confirma con un resultado positivo a PCR diremos que están infectados pero no enfermos. Y si es negativo debemos reconsiderar el diagnóstico y pensar en otras posibles causas. En cambio, el diagnóstico de leishmaniosis es concluyente en animales con títulos altos de anticuerpos (2-3 titulaciones por encima del punto de corte) acompañados de signos clínicos y/o alteraciones clínico-patológicas (que por otro lado suelen ser frecuentes). En estos últimos no sería necesario realizar PCR ya que tenemos una confirmación diagnóstica.


¿Qué es LeishVet?
LeishVet es una asociación científica presidida por Guadalupe Miró y formada por veterinarios académicos de diferentes países (especialmente aquellos donde la enfermedad es endémica) dedicados a la investigación y manejo clínicos de la leishmaniosis en Veterinaria. Su finalidad primordial es aydar a los veterinarios clínicos y a las autoridades sanitarias a mejorar el diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad y establecer una serie de recomendaciones que sean reconocidas internacionalmente y aplicables en toda Europa. Entre sus últimas actividades, se encuentra el Leish Vet Symposium (www.worldleish4.org).
X. R. La serología es una de las técnicas más utilizadas en el diagnóstico de la leish-maniosis canina. Esta técnica nos informa del título de anticuerpos que ha producido el paciente frente a la presencia de Leishmania. Suero y plasma son las muestras clínicas más utilizadas. Aunque su uso está muy extendido, puede ser difícil la interpretación de sus resultados. Los títulos normalmente son expresados en diluciones (1:80, etc.) o en porcentajes (150%, etc.). El problema principal es que la presencia de anticuerpos en un paciente es sólo circunstancial (puede significar que ha tenido contacto con Leishmania anteriormente) y, por tanto, no podemos afirmar categóricamente que en ese momento el paciente está infectado con ese agente patógeno. Un aumento de 4 veces en el título basal se puede considerar diagnóstico en la mayoría de los casos clínicos. A pesar de todo esto, el uso conjunto de la serología con la PCR aporta mucha más información que cada una por separado.

En su opinión, ¿qué debe transmitir el clínico al propietario de un perro con leishmaniosis confirmada?
G. M.
Lo más importante es informar al propietario del perro enfermo de las características de esta enfermedad crónica que requiere una monitorización exhaustiva (cada 3-4 meses el primer año) con los costes asociados que ello supone. Que aunque no existe ningún tratamiento 100% eficaz, los protocolos actuales de tratamiento, bien aplicados, proporcionan una recuperación clínica muy adecuada y una buena calidad de vida en un porcentaje muy elevado de los animales tratados (haciendo la salvedad de los perros con leishmaniosis asociada a enfermedad renal en los que el pronóstico es diferente, según cada caso).
Es importante mencionar además el carácter zoonósico de esta enfermedad para que tomen todas las medidas encaminadas a proteger al perro enfermo frente a las picaduras de flebotomos, lo que supone disminuir el riesgo de transmisión a las personas y a otros perros.

X. R. Sobre todo tranquilidad y claridad en la información sobre la leishmaniosis canina. Actualmente la mayoría de perros responden clínicamente al tratamiento, aunque muchos quedan infectados indefinidamente. Sin embargo, muchos de estos perros no vuelven a desarrollar signos clínicos y en algunos casos al cabo de un tiempo (1-2 años) se puede llegar a suprimir el tratamiento. A pesar de todo lo comentado, existen pacientes que necesitan tratamiento indefinidamente y otros que no responden a ningún tratamiento y finalmente se les debe realizar la eutanasia. Un perro con leishmaniosis, tratado y con un seguimiento periódico por parte de un veterinario tiene muchas posibilidades de vivir con una buena calidad durante años. Se debe recomendar siempre la prevención de los perros frente al vector transmisor de Leishmania, aunque estén ya infectados y en tratamiento.

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