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Verde, S. Villanueva-Saz, A. Loste, C. Marca y A. Fernández-Casasnovas
Servicio de Inmunopatología Clínica de Animales de Compañía
Departamento de Patología Animal
Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza
Imágenes cedidas por los autores

En las zonas geográficas donde la leishmaniosis canina (Lcan) es endémica, es muy frecuente que el clínico veterinario tenga que plantearse casi a diario la realización de pruebas laboratoriales para confirmar la infección bajo tres situaciones clínicas diferentes:

• En el ámbito de los programas preventivos para evaluar la situación de un perro que vive en una zona donde la infección es endémica.
• En casos con sintomatología clínica y/o alteraciones clinicopatológicas compatibles con Lcan.
• En los perros que han sido previamente vacunados frente a L. infantum y que presentan posteriormente signos clínicos y/o alteraciones clinicopatológicas compatibles con la enfermedad.

Ante cualquiera de estos tres supuestos, normalmente solicitaremos a los laboratorios pruebas serológicas para confirmar o descartar la infección. Las pruebas serológicas cuantitativas más comúnmente empleadas son IFI o ELISA (Maia & Campino, 2008).

Es evidente que la visualización directa del parásito en una citología de un perro clínicamente sospechoso permite confirmar la Lcan. La capacidad para detectar el parásito (sensibilidad) en perros infectados aparentemente sanos suele ser menor que en perros clínicamente enfermos. Sin embargo, la no detección del parásito no permite descartar la infección, por lo que se pueden dar muchos falsos negativos (Saridomichelakis et al., 2005b).

Por otra parte, tenemos que recordar que la Lcan es un proceso complicado en el sentido de que, en zonas endémicas, muchos perros han estado en contacto con el parásito pero no todos ellos van a desarrollar la enfermedad:

• El papel que tiene el sistema inmunitario del perro es clave en el avance o control de la infección, de tal manera que hay perros en los que la respuesta inmunitaria contra el parásito es altamente efectiva (estos perros son capaces de controlar la infección y es poco probable que desarrollen la enfermedad).
• Por el contrario, el sistema inmunitario es incapaz de proteger a otros individuos, bien porque no son inmunocompetentes o bien porque padecen otra enfermedad concurrente. Es en este grupo de individuos en el que la respuesta inmunitaria no es capaz de controlar eficazmente al parásito (respuesta inefectiva), lo que da lugar a la puesta en marcha de diversos mecanismos inmunopatológicos (reacciones de hipersensibilidad tipo II y III), así como procesos inflamatorios que serán los responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Villanueva-Saz, Ordeix i Esteve, Solano-Gallego, 2014).

En este marco, la interpretación de los resultados de las pruebas serológicas no se puede reducir a puro análisis matemático, sino que precisa del arte del análisis del clínico. Por ello, a través de este artículo queremos transmitir nuestras consideraciones con la finalidad de facilitar la toma de decisiones desde el punto de vista del control de la enfermedad y de la terapia.

En relación con Lcan, los clínicos veterinarios partimos de que debemos analizar la situación clínica del perro y determinar en cuál de las siguientes categorías se halla (tabla 1):

• Grupo 1: perro sano no infectado. No ha estado en contacto con el parásito (sin signos clínicos, sin alteraciones clinicopatológicas, serología negativa, PCR negativa).
• Grupo 2: perro infectado aparentemente sano. Ha estado en contacto con el parásito y se ha infectado, no presenta signos clínicos ni alteraciones clinicopatológicas, serología negativa o positiva (niveles bajos o medios) y PCR positiva o negativa.
• Grupo 3: perro enfermo (leishmaniosis clínica). Ha estado en contacto con el parásito, se ha infectado y ha desarrollado signos de enfermedad y/o alteraciones clinicopatológicas, serología positiva y PCR positiva.
• Grupo 4: perro vacunado con signos de enfermedad compatible con Lcan. Perro previamente vacunado y que ha desarrollado signos clínicos y/o presenta alteraciones clinicopatológicas compatibles con la enfermedad con una serología positiva. En este caso debería tratarse como un perro clínicamente sospechoso en el que el valor de la serología no es útil para el veterinario clínico.

El planteamiento diagnóstico

Perros aparentemente sanos

Para realizar el cribado de perros aparentemente sanos, las pruebas seleccionadas son a menudo las serológicas de tipo cualitativo. En el caso de que un perro presente un resultado positivo a la prueba rápida de cribado, será necesaria la determinación de los niveles de anticuerpos anti-Leishmania mediante una posterior prueba serológica de tipo cuantitativo.

Serología

En zonas endémicas para la infección, toda detección de anticuerpos anti-Leishmania es indicativa de exposición y contacto del sistema inmunitario del perro con el parásito:

• Si los niveles de anticuerpos son bajos, su presencia posiblemente sea detectada de forma transitoria, y su evolución podrá ser evaluada con una prueba serológica cuantitativa realizada posteriormente, en un plazo de 60-90 días (Baneth & Aroch, 2008). De igual forma, a la vez que se analiza la evolución de los niveles circulantes de anticuerpos, se realizará un seguimiento para la detección de cualquier signo clínico compatible con el desarrollo de la enfermedad.
• Por otro lado, los perros con ausencia de signos clínicos y alteraciones clinicopatológicas pero con unos niveles de anticuerpos anti-Leishmania cuatro veces superiores al punto de corte de la prueba serológica deberían ser considerados como perros enfermos. Por tanto, es igualmente necesario su seguimiento para una detección precoz de cualquier modificación de su estado (signos clínicos y/o alteraciones clinicopatológicas), y a partir de este momento es necesaria la aplicación de un tratamiento anti-Leishmania.

Proteinograma

Además, la realización de un proteinograma permitirá una mejor caracterización de la respuesta humoral del perro, y aportará información que será de ayuda al clínico para decidir si tratar (detección de alteraciones del perfil electroforético) o no tratar, y plantear un seguimiento estrecho de la evolución del perro.

• Los casos serológicamente negativos o positivos bajos con proteinogramas normales serán individuos que se incluirán en el grupo de los que se controlan anualmente en el programa de cribado.
• Los perros serológicamente positivos con niveles medios y con proteinograma normal se programarán para evaluación o seguimiento cada seis meses.
• Aquellos perros serológicamente positivos que presenten niveles medios de anticuerpos y proteinograma compatible con Lcan, así como los perros con altos niveles de anticuerpos, pueden hallarse en los primeros estadios de la enfermedad y los incluiremos en el grupo de enfermos de Lcan.

Perros con signos clínicos compatibles

En perros con signos clínicos o sospecha de enfermedad, realizamos un estudio de la historia clínica completa seguida de una exploración general y pruebas básicas de laboratorio (hematología, perfil bioquímico, proteinograma y urianálisis) (Paltrinieri & Solano-Gallego, 2010). En todos estos casos, realizamos al menos una prueba serológica cuantitativa para confirmar la infección.

Perros vacunados

En los perros vacunados frente a L. infantum y que han desarrollado posteriormente signos clínicos y/o alteraciones clinicopatológicas compatibles con la enfermedad, la mayoría de las técnicas serológicas convencionales no son capaces de discriminar la naturaleza de los anticuerpos presentes en el suero canino. Por ello será necesario recurrir a otras técnicas complementarias de confirmación de la infección (cuadro).

Las circunstancias por las que un perro vacunado desarrolla una leishmaniosis clínica son difíciles de conocer. Entre las más frecuentes están el que la eficacia de la vacuna comercializada frente a L. infantum no haya sido suficiente para proteger correctamente al paciente concreto o bien que se trate de un perro que antes de la primovacunación estuviese infectado (infectado aparentemente sano), dada la baja sensibilidad de algunas pruebas de cribado rápidas (Solano-Gallego et al., 2014). En este caso la administración de la vacuna frente a L. infantum supondría un verdadero desafío vacunal para el sistema inmunitario del animal.

Pruebas bioquímicas, hematológicas y urianálisis compatibles con leishmaniosis canina

Las alteraciones de laboratorio detectadas en un perro enfermo con leishmaniosis clínica variarán dependiendo del estadio clínico en que se encuentre el perro y de la propia respuesta del sistema inmunitario frente al parásito, por lo que la detección de alguna alteración clinicopatológica compatible con Lcan debe ser considerada en el protocolo de diagnóstico diferencial del caso clínico.

Bioquímica

Entre las principales alteraciones detectadas en el perfil bioquímico destaca el incremento de la concentración de proteínas plasmáticas (hiperproteinemia) (Koutinas et al., 1999) debido fundamentalmente a la hiperglobulinemia por una exagerada respuesta en la síntesis de anticuerpos anti-Leishmania. Al realizar la extracción sanguínea, es frecuente que el suero procedente de perros con Lcan muestre “gelificación”, lo que puede justificarse por el síndrome de hiperviscosidad del suero derivado de la hiperglobulinemia presente en estos animales (Petanides et al., 2008).

Además, también es posible observar una disminución de la concentración de albúmina (hipolbuminemia) debido a la lesión glomerular que se produce como consecuencia del depósito de inmunocomplejos que empieza siendo mínima (glomerulonefritis con albuminemia) y puede llegar a provocar un síndrome nefrótico (con pérdida de proteínas plasmáticas de peso molecular superior a la albúmina e hipoprotinemia grave).

Otra alteración que puede observarse es la elevación de las enzimas hepáticas: fosfatasa alcalina, aspartato-aminotransferasa o alanina-aminotransferasa (Petanides et al., 2008). En el caso de que haya afectación renal más allá de la glomerulonefritis, pueden verse afectadas todas las estructuras tubulares e intersticiales, lo que ocasiona una insuficiencia renal aguda o enfermedad renal crónica que se manifestará por hipostenuria, isostenuria y elevados niveles de BUN y creatinina.

Hematología

En la hematología es posible detectar, dependiendo de la gravedad de la enfermedad, anemia de leve a moderada no regenerativa normocrómica normocítica (Ciaramella et al., 1997). En ocasiones también puede aparecer anemia regenerativa, por una pérdida de sangre o como consecuencia del proceso inmunomediado.

En la serie blanca puede verse leucograma de estrés (neutrofilia, monocitosis y linfopenia), pero también leucopenia en casos graves (Ciaramella et al., 1997, Paltrinieri et al., 2010).

En algunos perros con leishmaniosis clínica puede presentarse trombocitopenia (Ciaramella et al., 1997).

Urianálisis

En el urianálisis de perros con Lcan pueden detectarse diferentes grados de intensidad de la proteinuria a través del ratio UPC (Todolí et al., 2009). Además, el examen del sedimento urinario permite la identificación de cilindros, lo que complementa la información sobre el grado de proteinuria y la lesión tubular. La densidad urinaria cuantificada mediante refractómetro puede ser indicativa de enfermedad renal en estadios iniciales (hipostenuria) (Cortadellas et al., 2008).

Proteinograma sérico

El perfil electroforético del suero permite analizar el tipo de hiperproteinemia, por hipergammaglobulinemia, que es muy característico de la Lcan. Desde un punto de vista laboratorial, en relación con la Lcan las principales alteraciones detectadas en el perfil electroforético son la elevación de las proteínas séricas, tanto de la fracción α-2 globulinas (Paltrinieri & Solano-Gallego, 2010) como de beta y gammaglobulinas (Koutinas et al., 1999), la alteración del ratio albúmina/globulina (Ciaramella et al., 1997) y la disminución de la albúmina sérica (hipoalbuminemia) (Paltrinieri & Solano-Gallego, 2010).

El patrón electroforético observado se corresponde generalmente con una hipergammaglobulinemia policlonal u oligoclonal (Paltrinieri & Solano-Gallego, 2010), o incluso monoclonal (Font et al., 1994). En ocasiones es posible detectar casos de leishmaniosis con hiperglobulinemias policlonales combinando fracciones beta y gamma (Ciaramella et al., 1997). Además, esta prueba es sumamente útil, puesto que nos permite evaluar la respuesta al tratamiento observando si se normalizan las diferentes fracciones alteradas en el momento del diagnóstico (Ciaramella et al., 1997).

Pruebas para confirmar la infección

Las pruebas de confirmación de la infección más comúnmente empleadas en la práctica clínica son las pruebas serológicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) (figura 1), la técnica del ensayo por inmunoasbosorción ligado a enzimas (ELISA) (figura 2) y las pruebas de inmunocromatografía también llamadas pruebas rápidas.

Figura 1. Inmunofluorescencia indirecta (IFI).

Figura 2. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Inmunocromatografía rápida

Las pruebas de inmunocromatografía rápida, a pesar de su cómodo formato, presentan unos rendimientos diagnósticos variables (Maia & Campino, 2008; Solano-Gallego et al., 2014), ya que en caso de resultado positivo es necesaria la posterior determinación del nivel de títulos de anticuerpos anti-Leishmania mediante una prueba serológica de tipo cuantitativo. Un resultado negativo en una prueba rápida en un perro clínicamente sospechoso no permite descartar la infección puesto que, en general, las pruebas rápidas presentan una sensibilidad inferior que las pruebas serológicas cuantitativas, por lo que es posible la existencia de falsos negativos (Solano-Gallego & Villanueva-Saz, 2014). Por otra parte, en caso de pacientes con resultado positivo que se vayan a tratar, también es necesario determinar el título de anticuerpos de partida con la finalidad de evaluar la respuesta a la terapia.

Técnicas serológicas cuantitativas

En el caso de las pruebas serológicas cuantitativas es importante que el laboratorio lleve a cabo las titulaciones o niveles de anticuerpos hasta la última dilución de la muestra que es positiva, y no solamente informe de un resultado positivo por encima del punto de corte de la técnica. De esta forma es posible conocer el nivel o títulos exactos de anticuerpos anti-Leishmania.

De forma general, en aquellos perros en los que se detecten niveles altos de anticuerpos anti-Leishmania (valores 3-4 veces superiores al punto de corte de la prueba serológica cuantitativa), el resultado se considerará concluyente para confirmar el diagnóstico de leishmaniosis canina (Solano-Gallego et al., 2009), puesto que la detección y cuantificación de elevados niveles de anticuerpos anti-Leishmania se asocian con elevada carga parasitaria y, por tanto, enfermedad (Reis et al., 2006).

En el caso de un perro clínicamente sospechoso en el que las técnicas serológicas aporten un resultado negativo, positivo bajo o incluso un resultado positivo medio, puede ser necesario utilizar otras técnicas complementarias de diagnóstico de confirmación de la infección como el estudio citológico (Mylonakis et al., 2005) (figura 3), el estudio histopatológico asociado o no a la técnica inmunohistoquímica sobre tejidos biopsiados o incluso la PCR (Solano-Gallego et al., 2009; Miró et al., 2008; Roura et al., 1999).

Figura 3. Citología procedente de una lesión cutánea de un perro enfermo. Tinción Giemsa, 40x.

Sin embargo, puede darse el caso de un perro clínicamente sospechoso y que previamente ha sido vacunado para la prevención de la Lcan en Europa. En este caso, son escasos los estudios que evalúan la capacidad de discriminación de las pruebas serológicas cuantitativas convencionales. Por ello, en estas circunstancias la interpretación del resultado serológico debería realizarse con cautela. Bajo este supuesto, el clínico veterinario debería utilizar otro tipo de pruebas laboratoriales complementarias para confirmar el diagnóstico de la infección como PCR, estudio histopatológico o inmunohistoquímica (Queiroz et al., 2011). Más fácilmente, si fuese posible la visualización directa del parásito en una citología procedente de una lesión del perro enfermo, el clínico podría confirmar la enfermedad.

PCR

En relación con la utilización de la PCR, cabe destacar que basar el diagnóstico de confirmación exclusivamente en un resultado positivo mediante PCR no sería la aproximación diagnóstica más adecuada, puesto que por el momento no permite discriminar entre perros infectados clínicamente sanos (que pueden tener una respuesta inmunitaria capaz de controlar la infección sin que lleguen a presentarse signos clínicos) de perros infectados enfermos (cuya respuesta inmunitaria es ineficaz en el control de la diseminación del parásito) (Miró et al., 2008). Además, en el caso de que se decida realizar esta técnica deberemos tener en cuenta que la sensibilidad de la misma puede variar dependiendo del origen de la muestra biológica seleccionada (Baneth & Aroch, 2008) (tabla 2). Actualmente se están investigando nuevos tipos de muestras, entre las que destaca el uso de hisopos orales, óticos y conjuntivales (de Ferreira et al., 2013), así como de origen vulvar (Hernández et al., 2015), nasal (de Ferreira et al., 2013) y muestras de pelo (Belinchón-Lorenzo et al., 2013). No obstante, la muestra no invasiva actualmente más estudiada ha sido la obtenida a través de los hisopos conjuntivales en comparación con otras muestras obtenidas por procedimientos no invasivos (Strauss-Ayali et al., 2004; Ferreira et al., 2008; Gramiccia et al., 2010; Leite et al., 2010; Carvalho Ferreira et al., 2014).

A día de hoy, con la PCR no se disponen de valores de referencia estandarizados a partir de los cuales interpretar resultados y proponer tratamiento anti-Leishmania. Por ello, en caso de que se decida utilizar PCR será necesario disponer de otras técnicas de confirmación de la infección (serología cuantitativa, citología, estudio histopatológico y técnicas de inmunohistoquímica) (Solano-Gallego et al., 2011).

Pruebas para la confirmación-diagnóstico de la infección por L. infantum

Diagnóstico parasitológico Examen microscópico directo Estudio histopatológico Técnica inmunohistoquímica Cultivo in vitro Xenodiagnóstico (investigación) Aislamiento en animales de experimentación (investigación) Diagnóstico molecular PCR convencional PCR anidada PCR cuantitativa Evaluación de la respuesta humoral Pruebas rápidas de inmunocromatografía Inmunofluorescencia indirecta Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas Prueba de aglutinación directa y variantes Contrainmunoelectroforesis (investigación) Western blot (investigación) Ensayos de inmunodifusión (investigación) Evaluación de la respuesta celular (investigación) Prueba de la leishmanina Estudio de la proliferación de linfocitos Medición de citocinas Otros (investigación) Citometría de flujo

La elección del tratamiento

Cuando obtenemos resultados positivos serológicos de rangos medios o altos, con signos clínicos, siempre se debe tratar al paciente. La duda se plantea cuando aparecen títulos de nivel medio o bajo sin signos clínicos ni alteraciones clinicopatológicas. En esta última situación, nosotros proponemos no tratar y hacer un seguimiento de control cada 3-6 meses de tal forma que, en el momento en que se detecten signos clínicos y/o alteraciones clinicopatológicas, se iniciaría el tratamiento anti-Leishmania.

El tratamiento más efectivo debe combinar alopurinol (10-15 mg/kg q 12 h, VO, 6-12 meses) con antimoniato de meglumina (50 mg/kg, q 12 h, SC, 6 semanas) o bien con miltefosina (2 mg/kg, q 24 h, VO administrado con la comida, 4 semanas). La elección de uno u otro fármaco leishmanicida se realizará en función de las características del caso clínico y de la capacidad de cumplimiento del tratamiento por parte del propietario.

En el tratamiento de la enfermedad, el aspecto fundamental es reducir lo más rápidamente posible la carga parasitaria con la finalidad de que reviertan las reacciones inmunológicas que están ocasionando la sintomatología clínica, que puede afectar a muchos tejidos corporales pero cuyas consecuencias más graves recaen en los riñones. Por ello, hay que aplicar el tratamiento leishmanicida en combinación con alopurinol para mejorar la situación clínica, con especial cuidado en los perros en los que la función renal está muy comprometida (estadios IRIS III y IV). En estos casos, la terapia debería iniciarse bajo el control de una unidad de cuidados intensivos para asegurar la estabilidad renal del paciente en los primeros días.

Finalmente, la administración periódica de alopurinol a una dosis diaria de 20 mg/kg una semana al mes durante el periodo de actividad del vector transmisor de la infección no previene la enfermedad en el perro, y tampoco ayuda a la eliminación del parásito en perros infectados sin clínica (Saridomichelakis et al., 2005). Recientes investigaciones han demostrado por primera vez la existencia de fenómenos de resistencia del parásito al alopurinol (Yasur-Landau et al., 2016). Estas nuevas informaciones hacen necesario un replanteamiento tanto de las pautas como de la duración de los protocolos en la utilización del alopurinol.

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