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N. Mendoza, R. Pérez-Pé, E. Martí, J.A. Cebrián-Pérez y T. Muiño-Blanco
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular
Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza
Imágenes cedidas por Joaquín Medina

La disponibilidad de espermatozoides con alta capacidad fecundante constituye un punto crítico para el progreso de la inseminación artificial, la fecundación in vitro y las nuevas tecnologías reproductivas en animales domésticos. La eficacia reproductiva podría incrementarse, entre otras posibilidades, por el conocimiento detallado y el manejo de los procesos que se producen en el espermatozoide desde su génesis hasta su fusión con el óvulo.

Aplicaciones prácticas

La inclusión de estos marcadores apoptóticos en el análisis de una muestra seminal, que va a ser usada para inseminación artificial, podría resultar de gran utilidad. Pero actualmente, debido al coste de los reactivos, quizás no puedan ser utilizados de forma rutinaria en los laboratorios de preparación de dosis seminales. Sin embargo, a la hora de testar sementales para su incorporación a un programa de mejora genética, hay que tener en cuenta que una buena calidad seminal, determinada por valoración de la motilidad o integridad de la membrana plasmática, no garantiza una buena capacidad fecundante. Además, es importante resaltar que algunos estudios han relacionado la existencia de espermatozoides apoptóticos no sólo con bajos resultados de fertilidad en algunas especies, sino también con problemas en el desarrollo posterior de los embriones. Por todo ello, en este caso, sí que sería recomendable el estudio de estos marcadores en el análisis de la calidad seminal de nuevos sementales. Y finalmente, el desarrollo de métodos de separación de espermatozoides apoptóticos de una muestra seminal también podría tener importantes aplicaciones prácticas a la hora de mejorar la capacidad fecundante de una dosis.

La inseminación artificial es una de las herramientas que más ha contribuido al avance de la producción animal. Mediante la inseminación artificial, un eyaculado de un animal de alto valor genético puede usarse para inseminar a gran cantidad de hembras, y además se evita la propagación de enfermedades de transmisión sexual. Sin embargo, la inseminación artificial en la especie ovina no está ampliamente difundida, debido principalmente a los bajos resultados de fertilidad obtenidos, en general, con semen refrigerado o congelado. Esto parece ser debido, entre otras causas, a la especial susceptibilidad al frío de los espermatozoides ovinos en comparación con los de otras especies que posibilitan que las dosis seminales se refrigeren o congelen sin problema.


Aunque las dosis usadas para inseminación artificial se evalúan previamente de forma rutinaria en los centros de reproducción animal, la mayoría de los parámetros seminales analizados no muestra una correlación aceptable con la fertilidad obtenida. Por ello, se hace necesaria la inclusión de nuevos parámetros de análisis seminal que permitan mejorar la capacidad predictiva de la fertilidad obtenida con esas dosis seminales.

A lo largo de los años se han desarrollado distintos métodos para intentar predecir la fertilidad de un animal o de una muestra seminal dada. Estos ensayos llevados a cabo en los laboratorios podrían dividirse en análisis básicos del semen y análisis de la funcionalidad espermática.
El análisis básico del semen incluye el estudio de parámetros que podríamos definir como “clásicos”, como son el volumen y concentración del eyaculado, la motilidad (estimada visualmente o por métodos asistidos por ordenador, como el sistema CASA), la morfología espermática o la integridad de la membrana plasmática. La principal ventaja de estos métodos es su bajo coste y su relativa simplicidad, pero la mayoría de ellos, considerados individualmente, presentan el inconveniente de su baja correlación con la fertilidad.
Por otro lado, entre los análisis de funcionalidad espermática se pueden citar la capacidad de experimentar el proceso de capacitación espontáneamente o de llevar a cabo la reacción acrosómica, así como diversos ensayos de unión a zona pelúcida (ZBA) o de penetración del ovocito. Estos ensayos son más complejos y costosos y, aunque algunos de ellos se utilizan en la especie humana para detectar anomalías de infertilidad, la mayoría fallan en la predicción de la fertilidad de muestras seminales que entran en los rangos aceptables de normalidad.

Instalaciones de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza. Fuente: Joaquín Medina. Servicio de Audiovisuales de la F. Veterinaria

Actualmente se están realizando multitud de trabajos relacionados con el estudio de la apoptosis en espermatozoides. La apoptosis, a diferencia de la necrosis, es un tipo de muerte celular controlada que termina con la autodestrucción de la célula sin producir respuesta inflamatoria. Está claro que existe apoptosis durante la espermatogénesis, y que cumpliría dos funciones: la primera, limitar la población de células germinales a la capacidad de las células de Sertoli; y la segunda, eliminar los espermatozoides anormales. Pero también existen espermatozoides apoptóticos presentes en semen eyaculado, aunque la razón de su presencia no está tan clara todavía. Algunos autores la atribuyen a la existencia de espermatozoides inmaduros, otros a un fenómeno de “apoptosis testicular abortada”, y otros a causas patológicas. Sin embargo, sea cual sea la causa, la presencia de espermatozoides apoptóticos en las dosis seminales se ha relacionado con bajos resultados de fertilidad en algunas especies como la bovina. Por ello, el estudio de la apoptosis en una muestra espermática podría resultar de gran interés para la predicción de la capacidad fecundante de dicha muestra.
La apoptosis es un proceso secuenciado que incluye diferentes etapas, por lo que existen numerosas formas de evaluar este fenómeno. Entre ellas podemos citar la fragmentación del ADN, que ocurre al final del proceso, o bien otras alteraciones que se producen en estadios más tempranos, como la translocación de fosfadilserina de la membrana plasmática. La fosfatidilserina es un fosfolípido que en condiciones normales se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática y que, durante la apoptosis, pasa a la cara externa de la misma. Ésta sería la señal de reconocimiento para que la célula fuese fagocitada sin producir respuesta inflamatoria. Además, en el proceso de apoptosis están implicadas las caspasas, unas proteasas responsables de la fragmentación de sustratos específicos. Diversos trabajos han mostrado evidencias de translocación de fosfatidilserina, de fragmentación de ADN y de actividad de caspasas en espermatozoides de mamíferos de diferentes especies.
Por tanto, la evaluación de cualquiera de estos eventos, o de varios de ellos en conjunto, proporciona información sobre el porcentaje de espermatozoides apoptóticos en una muestra seminal dada.

Figura 1. Espermatozoides viables (V), apoptóticos (A) y muertos (M) vistos al microscopio de fluorescencia con distintos filtros.

Nuestro grupo de investigación ha sido pionero en el estudio del proceso apoptótico en espermatozoides ovinos. Recientemente hemos demostrando que fenómenos como la translocación de la fosfaditilserina, la fragmentación del ADN o la activación de caspasas ocurren en semen ovino fresco.
La translocación de fosfatidilserina se detecta mediante el uso de una proteína, la anexina, que presenta gran afinidad por ella. Si la anexina va unida a un fluorocromo, podremos observar, mediante un microscopio de fluorescencia, aquellos espermatozoides con translocación, es decir, con características de apoptosis. Si, además, se combina la anexina con un marcador de integridad de membrana que presente una fluorescencia distinta, podremos determinar en una misma muestra espermatozoides viables, apoptóticos y muertos (figura 1).
En cuanto a la fragmentación del ADN, también puede evidenciarse usando un microscopio de fluorescencia mediante una técnica denominada TUNEL. En este caso, una enzima incorpora nucleótidos marcados con fluorescencia a los extremos de los fragmentos de ADN (figura 2). Así mismo, el porcentaje de espermatozoides con caspasas activas también puede determinarse usando un sustrato que sea cortado específicamente por esas proteasas dando lugar a un producto fluorescente.
Cualquiera de estos análisis puede realizarse usando un microscopio de fluorescencia, pero si tenemos un elevado número de muestras podemos recurrir a un citómetro de flujo, que permite evaluar 10.000 células en unos pocos segundos.

Figura 2. Espermatozoides ovinos vistos al microscopio con campo claro (izquierda) y bajo fluorescencia (derecha). Los espermatozoides con fluorescencia verde tienen el ADN fragmentado.

Hemos observado que la refrigeración, aplicando una bajada controlada de temperatura hasta 5 ºC, produce un aumento de los marcadores apoptóticos indicados. Además, estos marcadores aumentan de nuevo cuando la muestra pasa a 37 ºC, simulando la temperatura fisiológica al alcanzar el tracto reproductor femenino (gráficas 1 y 2). Estos aumentos podrían explicar, al menos en parte, el daño producido en esta especie por la refrigeración. Sin embargo, hasta el momento, no se sabe cómo está afectando la presencia de espermatozoides apoptóticos a la fertilidad en la especie ovina. A ese respecto, nuestro grupo está llevando a cabo un estudio muy interesante en colaboración con el Centro de Selección y Reproducción Animal de la Diputación General de Aragón (CENSYRA, Movera, Zaragoza). Partiendo de semen obtenido de sementales de la raza Rasa Aragonesa se preparan las dosis seminales refrigeradas siguiendo el protocolo habitual del centro. Una alícuota de las mismas dosis usadas para inseminación artificial se envía a nuestro laboratorio y allí se analizan parámetros clásicos o rutinarios, como la motilidad y la integridad de membrana, junto con otros menos comunes, entre los que se encuentran los marcadores apoptóticos. Los resultados se comparan entre sí y, posteriormente, con los datos de fertilidad proporcionados por el CENSYRA y obtenidos tras la inseminación artificial con dichas dosis. De esta manera, esperamos que en un corto plazo de tiempo podamos tener información sobre la relación entre apoptosis y fertilidad en la especie ovina. Por otro lado, el estudio de los marcadores apoptóticos resulta crucial para valorar cómo afectan a los espermatozoides diversos procesos de manipulación llevados a cabo en el laboratorio. Así, hemos observado que la inducción de la capacitación o la reacción acrosómica in vitro también producen un aumento de dichos marcadores. Además, el procesado de las muestras seminales, concretamente la eliminación del plasma seminal y selección de dosis destinadas a inseminación, también puede afectar al porcentaje de espermatozoides apoptóticos en la muestra final. Así, en un estudio reciente que compara cuatro técnicas de preparación espermática (swim-up/dextrano, centrifugación en gradiente de Percoll, lavado en sacarosa y filtración), se concluyó que el método de swim-up/dextrano puesto a punto hace unos años en nuestro laboratorio, no sólo era mejor en cuanto a selección de espermatozoides viables y con la adecuada motilidad, sino también en relación a los no-apoptóticos.

Agradecimientos
Los autores desean expresar su agradecimiento a ANGRA y Carnes Oviaragón por su apoyo a lo largo de todos estos años, así como la financiación concedida por el Gobierno de Aragón (DGA-A26/2007) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología (CICYT-FEDER AGL 2005-02614, CICYT-FEDER AGL 2007-61229). También a Santiago Morales y al personal del Servicio de Apoyo de Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza por su inestimable ayuda en la recogida del semen. Y finalmente a Joaquín Medina, autor de algunas de las fotos que aquí se presentan.

Bibliografía en poder de los autores