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Pérez-Écija, RA
Estepa, JC
Mendoza, FJ.
Dpto. Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria
Universidad de Córdoba (España)
Imágenes cedidas por los autores

Este método nos permite, mediante una técnica de fácil realización y bajo coste, obtener rápidamente contajes de células de la serie roja y blanca y, lo que es más importante, identificar anomalías morfológicas o lesiones específicas de ambas series que suelen ser uno de los signos más tempranos en numerosas enfermedades (linfomas, anemias inmunomediadas, procesos parasitarios, etc.).

La presente revisión tiene por objeto poner a disposición del veterinario clínico una guía rápida y de fácil comprensión acerca de la evaluación y caracterización de las lesiones más comúnmente identificadas mediante citología sanguínea en pequeños animales, así como establecer los principales diagnósticos diferenciales en función de las mismas.

Para cumplir con este objetivo, enumeraremos en cada apartado los procesos que afectan a hematíes, leucocitos (diferenciando entre monocitos, linfocitos y granulocitos) y plaquetas. Dentro de cada uno de los apartados se diferenciarán tanto los procesos que afectan a estos componentes cuantitativamente, como las patologías con efecto sobre la morfología de las células sanguíneas.
Debido a lo extenso del tema, hemos dividido esta revisión en varias partes. En esta primera parte trataremos de forma específica las diferentes técnicas tintoriales que existen a disposición de los clínicos, con indicaciones sobre la correcta metodología y los distintos artefactos que suelen aparecer en la citología sanguínea.

Técnicas de tinción
A la hora de realizar una correcta evaluación de una extensión sanguínea es esencial conocer el tipo de técnica histoquímica realizada sobre la misma. Este conocimiento también nos servirá a la hora de formular el diagnóstico, pues existen determinadas técnicas específicas para la visualización de ciertas características a nivel celular o agentes patógenos. Igualmente, hemos de tener constancia de que la muestra ha sido recolectada adecuadamente y la extensión o frotis se ha realizado correctamente para así poder discernir los artefactos que pueden aparecer a consecuencia de estos fallos y que pueden dirigirnos hacia un diagnóstico erróneo.

Normalmente, las tinciones usadas en los laboratorios hematológicos son las denominadas de tipo Romanowsky, las cuales se basan en el uso combinado de los colorantes eosina y azul de metileno. Con este tipo de tinción se pueden distinguir los siguientes aspectos morfológicos de las células:
1.- La forma y dimensión de los hematíes (de color rosa pálido), leucocitos (células nucleadas) y plaquetas (pequeños corpúsculos).
2.- El núcleo: de color púrpura.
3.- El citoplasma: de color azulado, si bien a veces presenta coloración grisácea en los linfocitos y monocitos.
4.- Granulaciones: son características de los granulocitos y tienen diferente color según la célula en cuestión. Así, pueden aparecer como una mezcla de colores pardos (neutrófilos), anaranjados (eosinófilos) o bien azul oscuro (basófilos).

Dentro de este tipo de tinciones, unas de las más conocidas son las denominadas rápidas, como las basadas en el método “Diff-Quick” o el “Dip-Stat”, ambas de uso extendido en las clínicas veterinarias debido a su facilidad y rapidez. La técnica “Diff-Quick”, por ejemplo, se realiza en tres pasos, tras el secado de la extensión:
1.- Fijación, utilizando metanol.
2.- Tinción de elementos formes con eosina.
3.- Contratinción de elementos nucleares y con basofilia usando el azul de metileno.

Sin embargo, este tipo de tinciones rápidas presentan ciertos inconvenientes, como la formación de precipitados, si se usa sangre con heparina como anticoagulante, o la incapacidad de distinguir ciertos elementos intracelulares como parásitos hemáticos, etc.

Otras tinciones de tipo Romanowsky más específicas a las que podemos acudir para apreciar más correctamente determinados cambios morfológicos, o bien para la identificación de ciertos parásitos o componentes celulares, son las siguientes:
• Tinción de Giemsa. Muy buena para valorar la morfología celular y permite la identificación de ciertos hemoparásitos como p.ej. Babesia spp.
• Tinción de Wright. Ideal para evaluar la morfología celular y muy buena para identificar los gránulos citoplasmáticos.

De manera general, estas tinciones de tipo Romanowsky son suficientes para evaluar muestras hematológicas. Sin embargo, si queremos diferenciar más específicamente detalles nucleares o nucleolares (por ejemplo, a la hora de identificar células neoplásicas) podemos optar por otro tipo de técnicas como la tinción de Papanicolau.

La tinción NMB (nuevo azul de metileno o “New Methylene Blue”) es una de las denominadas tinciones vitales que más ampliamente se usa para distinguir entre eritrocitos maduros e inmaduros en citología sanguínea. Las formas maduras se tiñen de manera homogénea mientras que los eritrocitos inmaduros (que aún conservan restos de ribosomas en su citoplasma) presentan gránulos azulados oscuros. La mayoría de los reticulocitos caninos presentan unos precipitados azulados de considerable tamaño que se corresponden a los polirribosomas (figura 1), por lo que también se denominan reticulocitos “agregata”. En el caso de los gatos también pueden aparecer como pequeños gránulos aislados positivos a la tinción (reticulocitos punctata). Este último subtipo se ha de diferenciar de Hemobartonella felis o artefactos de tinción.

Artefactos en los frotis sanguíneos
En numerosas ocasiones podemos encontrar en las extensiones hallazgos que pueden orientarnos hacia un diagnóstico erróneo y que aparecen debido a fallos en la recolección de la sangre, preparación del frotis o la técnica de tinción. Es de suma importancia poder reconocer estos artefactos y saber diferenciarlos de otros hallazgos que sí tienen importancia diagnóstica. Los artefactos más comunes en extensiones sanguíneas de pequeños animales son los siguientes:

Eritrocitos crenados (crenocitos)
Son especialmente frecuentes en extensiones de sangre felina. Se trata de eritrocitos con numerosas proyecciones puntiagudas, cortas, uniformemente repartidas por toda la superficie de la membrana. Pueden aparecer debido a un secado muy lento de la preparación, o por un exceso de anticoagulante en la muestra, así como por fallos en el almacenaje (figura 2). Estos crenocitos también pueden aparecer a veces en animales con fluidoterapia hipertónica muy agresiva.

Torocitos o células perforadas
Son eritrocitos que presentan el halo central llamativamente pálido y con una transición muy brusca a la zona periférica coloreada, la cual presenta un tono normal e incluso aumentado (figura 2). Este tipo de hallazgo suele responder a un artefacto de la preparación y hemos de diferenciarlo de la hipocromasia, que cursa con una disminución generalizada de la coloración de los hematíes.
• Efectos de envejecimiento de la muestra. Idealmente el frotis se ha de realizar con la sangre recién tomada. Un inadecuado almacenaje de la muestra o cuando trascurre demasiado tiempo entre la toma de la misma y la preparación de la extensión provoca una serie de artefactos, que son más llamativos en la línea blanca. Estos cambios pueden ser tanto a nivel nuclear (picnosis nuclear- núcleos homogéneamente basófilos y retraídos- , cariorrexis - núcleos fragmentados, sobre todo visible en los granulocitos-); como en el citoplasma celular (aparición de vacuolizaciones, o restos nucleares, fenómeno este último conocido como cariolisis).



Defectos tintoriales
Son muy comunes y para descartarlos podemos comparar muestras de diferentes animales. Para evitar su aparición es esencial controlar la calidad de los colorantes y también el pH del agua de lavado, que puede interferir con la tinción. Como defectos tintoriales más comunes, podríamos destacar los siguientes:
• Una tinción llamativamente pálida del núcleo celular, sin otros cambios tintoriales, suele aparecer cuando se produce una “fatiga” del azul de metileno (por excesivo uso, suciedad, etc.).
• Una tinción demasiado azulada en una técnica tipo Romanowsky se suele deber a excesivo tiempo en el colorante basófilo, lavados inadecuados, preparaciones muy gruesas, pH muy alcalino del buffer o de los diluyentes, exposición a formol, fijación de la muestra cuando la misma aún estaba húmeda, fijación demasiado tardía o portaobjetos defectuosos.
• Una tinción excesivamente rosada se debe a un tiempo insuficiente de tinción en el colorante básico, lavados demasiado prolongados, pH ácido de los productos, tiempos inadecuados en ambos colorantes o montaje antes de que la preparación esté completamente seca.
• También podemos encontrar una tinción desigual en diferentes zonas del portaobjetos por variaciones de pH en la superficie del mismo (p.ej. portaobjetos sucios), lavado desigual, colorantes distribuidos desigualmente, etc.

Precipitado de los colorantes
Suele aparecer debido a un filtrado inadecuado de los mismos, lavado inadecuado, portas sucios, etc. Es más común en la técnica de Wright que en tinciones rápidas como el Diff-Quick, pero hemos de diferenciar estos precipitados de inclusiones intracelulares.

Cuerpos refringentes en los eritrocitos
Un secado inadecuado de la muestra puede provocar la aparición de estas estructuras vacuolares dentro de los eritrocitos que suelen ser refringentes y a veces se rodean por el colorante.

Evaluación de la tinción y extensión
Antes de iniciar el estudio de cada uno de los componentes de una extensión sanguínea necesitamos valorar la adecuada realización de la misma. Para ello visualizaremos a pocos aumentos el tipo y calidad de tinción, la distribución de las células y comprobaremos las zonas donde las mismas se disponen formando una monocapa (figura 3). Es esencial realizar la valoración de las células, sobre todo la de los eritrocitos, en esta zona de menor celularidad. Si encontramos problemas a la hora de obtener esta monocapa una opción es disminuir el ángulo de incidencia del portaobjetos que realiza la extensión, consiguiendo así una monocapa más extensa. Por el contrario, si la muestra procede de un animal muy anémico y no conseguimos una suficiente densidad celular, podemos hacer lo contrario en pos de una valoración más cómoda.

Esta monocapa, sobre la cual vamos a realizar el estudio citológico, suele aparecer en las zonas más distales de la extensión, y se reconoce porque es transparente al trasluz. Sobre esta zona y, a pocos aumentos (10-20x), podremos realizar un primer estudio somero tanto de componentes de la serie roja como blanca. A estos aumentos podemos valorar la proporción relativa de cada componente celular y también reconocer grandes parásitos hemáticos (como microfilarias).

Más tarde, con mayores aumentos (40x) podemos observar y valorar cada uno de los elementos formes sanguíneos y, en el caso de que queramos identificar ciertos hemoparásitos o cambios morfológicos más finos en los glóbulos blancos, usaremos el objetivo de inmersión (100x).

En animales normales los eritrocitos aparecen individualizados y cercanos entre sí en la zona de monocapa, mientras que en zonas más gruesas de la preparación aparecen numerosas capas de eritrocitos superpuestas que apenas dejan adivinar su morfología.

En animales con una anemia severa los eritrocitos en la monocapa aparecen muy distanciados y la zona más gruesa únicamente presenta una o dos capas de hematíes. Estos hallazgos han de confirmarse con un estudio del hematocrito y contajes si es posible.

Respecto a la serie blanca, se pueden realizar contajes rápidos de la misma a pocos aumentos, usando para ello tablas de conversión y la cámara Neubauer; pero, sobre todo, la citología sanguínea nos permitirá evaluar la morfología de estas células a mayores aumentos (40-100x).

Las plaquetas, cuyo tamaño es inferior al resto de elementos formes, pueden ser valoradas también a 40-100x.

En todos los casos expuestos, hemos de conocer los valores normales que ha de arrojar el contaje de células en animales sanos (tabla 1).

Bibliografía

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