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Revisión de las técnicas de reproducción asistida en perros

Información para mejorar las prácticas sobre este tema y asesorar a los clientes


Melania Santana Cruz
Dra. Veterinaria. Reproducción Canina
GPCert (SAR) European School of Veterinary Postgraduate Studies
Centro Veterinario Cania. Las Palmas
Imágenes cedidas por la autora

La reproducción asistida tiene sus inicios en el siglo XVIII, cuando Spallanzani describe la primera inseminación artificial y nacimiento de tres cachorros en Italia (Fastad, 2000). A partir de ese momento, la tecnología reproductiva comenzó a experimentar un intenso auge, y se realizaron numerosos estudios destinados a determinar y mejorar los procesos relacionados con el control de la hembra en celo, la evaluación del semen y su conservación mediante refrigeración y congelación seminal, y su posterior aplicación mediante protocolos de inseminación artificial. Y así surgieron los servicios veterinarios especializados en la reproducción de pequeños animales.

Al mismo tiempo, el papel del perro en la vida del hombre sigue evolucionando de forma que, si bien aumenta el número de animales de compañía, los canes intervienen cada vez más en actividades específicas relacionadas con la exposición y belleza canina, la colaboración policial, el apoyo a los discapacitados y como deportistas de alta élite. Esta última parte requiere la selección de buenos ejemplares y la perpetuación de su genética con el fin de conservar sus características, si puede ser sin necesidad de la presencia de ambos reproductores, de modo que se pueden realizar cruces de grandes ejemplares en la distancia.

Asimismo, la alta selección de los animales hace que la capacidad reproductiva de los mismos se vea mermada debido a la elevada consanguineidad, por lo que en muchos casos se necesitan estas técnicas de asistencia reproductiva para poder conseguir una gestación con éxito.

En la actualidad no es raro que en la consulta veterinaria se nos solicite información por parte de propietarios particulares y de la mano de profesionales del mundo del perro sobre las últimas técnicas de reproducción asistida y con qué cuentan para ello. Sin embargo, el desconocimiento por parte de los clínicos de las técnicas y las posibilidades existentes en cuanto a la reproducción asistida hace que el asesoramiento en este ámbito muchas veces sea deficiente.

El presente artículo intenta hacer un efímero repaso de las mismas con el fin de ayudar al clínico a poner en marcha en consulta prácticas que le ayuden a mejorar sus éxitos reproductivos o, en su defecto, poder asesorar y ofrecer a sus clientes las opciones con las que cuenta de la mano de un compañero especialista en la materia.

Control de la perra para determinar el momento de la monta/inseminación

El estudio del ciclo en la hembra canina para determinar el pico exacto de fertilidad es parte fundamental de cualquier proceso de reproducción asistida que se precie. Debemos recordar que ésta solamente es capaz de fecundar 2-3 días del ciclo, si bien ese momento varía mucho entre perras, por lo que sobra indicar que esto se convierte en algo clave para el éxito a la hora de gestar una hembra canina. Las técnicas usadas para ello son:

Citología vaginal

La extracción de muestras vaginales mediante hisopo y el estudio de las células tras la tinción con Diff-Quick es la técnica más utilizada en la clínica veterinaria. A través de ella establecemos los porcentajes celulares en función de su morfología (células parabasales, intermedias o superficiales, entre otras como hematíes, neutrófilos, etc.) estableciendo en qué fase del ciclo se encuentra la perra, así como descartar infecciones a este nivel que pueda alterar la fertilidad de la perra (figura 1).

Figura 1. Citología vaginal a 40X de estro con tinción Diff Quick.

Desde hace unos años se ha puesto en marcha el uso de tinciones diferenciales como la de Harry-Shorr que nos permite teñir las células en función de su acidofilia y su basofilia. Este tipo de tinciones, si bien son más largas y algo más caras, nos permiten establecer con mayor precisión los porcentajes celulares en vagina y por tanto, determinar con mayor exactitud si la perra se encuentra en proestro, estro o diestro, si bien nunca nos permite saber el momento óptimo de fecundación de la perra (figuras 2 y 3).

Figura 2. Citología vaginal a 10X de estro con tinción Diagnoestrus RAL.
Figura 3. Kit de tinción diferencial Diagnoestrus RAL.

Progesterona

Sin duda esta es la técnica estrella en la reproducción asistida de la hembra reproductora. Para la medición de los valores plasmáticos de esta hormona debemos extraer sangre, preferiblemente por las mañanas, y realizar su determinación cuantitativa en plasma o suero en centros laboratoriales. Es importante hacer la conservación y el envío de las muestras en frío (refrigerada o congelada) con el fin de evitar su degradación. Los resultados suelen estar disponibles entre 8 y 24 horas después.

Con ello podemos determinar el pico de LH cuando los valores de progesterona son de 1,5-2 ng/ml, el momento justo de ovulación cuando se alcanzan los valores en torno a 5-8 ng/ml, situándose en 10-25 ng/ml en el momento de la fecundación (Lucas X., 2014). Si bien hay muchos protocolos para poner este tipo de mediciones en marcha, recomiendo comenzar las mediciones de progesterona cuando la perra inicia la fase de estro (más de un 70 % de células superficiales), y repetirla cada dos días hasta el momento de la ovulación.

En función de estos resultados se pueden programar de forma exacta las montas/inseminaciones, con especial interés cuando debe usarse semen procesado (refrigerado y congelado). De esta forma, teniendo en cuenta el proceso de maduración que deben sufrir los óvulos en la hembra canina para alcanzar su capacidad de fecundar (Reynaud y cols., 2005) y la durabilidad (hasta varios días) del semen fresco en el tracto reproductivo de la hembra, podemos concretar qué:

La perra es fértil y por tanto, puede quedar gestante, desde la ovulación hasta 4 días después. Sin embargo, la fecundación como tal sucede desde los 2 a los 4 días tras la ovulación, recomendándose montar o inseminar con semen fresco entre los días 1 y 4 tras la misma, si bien si esto se va a realizar con semen refrigerado debe acotarse al periodo comprendido entre el 2º y 4º día posovulación (England y Concannon, 2002) (figura 4).

Además, la determinación de los niveles plasmáticos de progesterona nos permite establecer de forma más concreta el tiempo de gestación y con ello, mejor exactitud en el control del parto.

Otras técnicas

Otros autores han desarrollado técnicas para determinar la ovulación en la perra a través del uso del seguimiento ecográfico de los ovarios (Levý y Fontbonne, 2007) y del estudio de los cambios que acontecen en la mucosa vaginal a lo largo del celo (Moxon y England G., 2012). Sin embargo, la falta de exactitud y la complejidad de estas técnicas hacen que se presenten poco prácticas para el clínico veterinario.

Manejo del semen canino y opciones de criopreservación

La tecnología seminal nos aporta información sobre cómo hacer un manejo correcto del semen, así como las posibilidades de conservación del mismo.

La extracción del semen por estimulación manual (masaje prepucial seguido de exteriorización del pene y contracciones sobre el bulbo del glande) sigue siendo uno de los métodos más sencillos y útiles, ya que permite aislar las tres fracciones del eyaculado, fundamental para realizar inseminación artificial o crioconservación, ya que tanto la primera fracción y como la tercera (procedentes de próstata) son innecesarias. La utilización de un reclamo sexual como una hembra en celo para incrementar la libido y estimulación del perro en la recogida seminal es innecesario en machos entrenados o habituados al procedimiento de obtención de semen (Kutzler, 2005). Para la recogida se recomienda utilizar tres embudos de plástico flexible para evitar el vidrio por el riesgo de corte colocado sobre un tubo colector previamente atemperado a 37 ºC (Fontbonne 2008a), aunque actualmente otros autores defienden que esto no es necesario ya que el choque térmico del semen en perros no es tanto como en otras especies (Root, 2010) (figura 5).

Figura 5. Extracción seminal.

Semen fresco

A pesar de lo dicho, de manera general el semen canino no debe someterse a cambios bruscos de temperatura, alteraciones mecánicas fuertes como una excesiva agitación, ni contacto con sustancias como el agua, germicidas y detergentes (Kutzler, 2005). Por esta razón, tras la correspondiente recogida seminal, el semen canino se debe conservar en baño María a 37 ºC y la temperatura ambiente de 20 ºC, evitando alteraciones hasta el momento de su utilización (Lucas X, 2014). En estas condiciones, la viabilidad del semen fresco tras la recogida es limitada por lo que debe usarse inmediatamente o bien iniciar los procedimientos de dilución, preservación y/o transporte.

Tanto para su uso directo o si va a ser sometido a criopreservación, se hace imprescindible una evaluación seminal para determinar la calidad del semen mediante la determinación de los parámetros de color, volumen, motilidad espermática, concentración/número de espermatozoides totales y morfoanomalías, como mínimo (Fontbonne 2008a; Root, 2010).

Semen refrigerado

La temperatura es uno de los parámetros de mayor importancia a la hora de preservar la calidad del semen, de forma que una disminución controlada y progresiva de la misma nos permite una conservación de los eyaculados, desde varias horas hasta varios días. En este sentido, la refrigeración del semen se convierte en una herramienta muy útil en la cría canina; además, si a esto añadimos la sencillez de la técnica, los bajos costes y el alto nivel de éxitos, explicaría que la refrigeración del semen en la especie canina se haya convertido en una de las técnicas de preservación seminal en los últimos años por veterinarios clínicos.

Antes de comenzar los espermatozoides deben ser aislados de los restos de fracción prostática que hayan podido quedar durante la recogida; para ello se centrifuga a 700 g durante 5-6 minutos, sin añadir ningún tipo de medio previamente. A continuación, se procede a realizar la dilución. Los diluyentes (elaborados a base Tris-citrato, azúcares como la glucosa/fructosa, antibióticos y yema de huevo) pueden prepararse de forma manual (Hermansson y Linde-Forsberg, 2006; Peña y cols. 2006). No obstante, en la actualidad contamos con diluyentes comerciales que se fabrican exclusivamente para diluir el semen canino que, si bien suelen ser caros, son más homogéneos en su producción y cómodos para los clínicos.

Tras la correspondiente dilución, el semen se enfría a 4 ºC gradualmente, durante un periodo de 1,5 a 2 horas y, luego, se almacena a dicha temperatura intentando utilizarlo en las primeras 24 horas, si bien los espermatozoides pueden mantener la supervivencia de 2 a 4 días, incluso 7 si se trata de semen de buena calidad (Fontbonne, 2008b).

Para el transporte suelen comercializarse unas cajas acolchadas específicas que contienen algún dispositivo de frío como bloques de hielo y una región reservada para mantener protegido el semen procesado. Al igual que sucedía para los diluyentes, existen contenedores comerciales para el transporte del semen refrigerado que, en ocasiones, forman parte de un kit que incluye diluyentes y contenedor de transporte (figura 6).

Figura 6. Kit de transporte de semen refrigerado.

El envío debe ser urgente (menos de 24 horas, máximo 48), identificándose como material biológico refrigerado acompañado como mínimo de un certificado sanitario del animal y un documento de no peligrosidad sobre la mercancía transportada. No obstante, la documentación necesaria debe confirmarse con la compañía de mensajería ya que puede variar en función de los tránsitos y las regiones.

Semen congelado

Cuando se trata de periodos de preservación cortos, la refrigeración se considera un método de conservación seminal más efectivo que la congelación del semen, pero si el almacenaje y transporte requiere más de 5 días para su uso, en lugar de la refrigeración, la mejor opción pasa a ser la congelación del semen (England y Ponzio, 1996). No obstante, la congelación seminal canina ofrece ciertas ventajas sobre el semen refrigerado como la difusión de los rasgos genéticos de determinados ejemplares a lo largo de tiempo y del espacio, pues elimina la necesidad de transportar a las hembras para inseminar en largas distancias y permite el comercio del semen y la creación de bancos de genes. Además, esta técnica permite la prevención de enfermedades, posibilidad de prescindir de la presencia de machos en lugares de investigación y criaderos, etc.

El proceso de congelación seminal es bastante complejo, ya que requiere de la centrifugación, dilución con diluyentes de composición especial diseñados específicamente para ello y bajada progresiva de temperatura hasta su congelación en vapores de nitrógeno líquido, para posteriormente sumergirlo y mantenerse almacenado a -196 ºC durante tiempo indefinido. Este proceso requiere instrumental y formación adecuada, por lo que sólo se podrá realizar en sitios específicos como centros de referencia y bancos de semen (figura 7).

Figura 7. Semen congelado: almacenamiento en pajuelas en tanque de nitrógeno líquido.

Por otro lado, esta técnica sigue presentando una serie de limitaciones.

Limitaciones de la congelación de semen

La variable capacidad que presentan los espermatozoides e individuos para resistir la criopreservación (Eilts, 2005), por lo que sólo el semen fresco de excelente calidad sería apto para congelación.

Los bajos índices de fertilidad y prolificidad, con una tasa de gestación de en torno al 60-70 % derivada de la baja motilidad y aumento de morfoanomalías de espermatozoides sometidos a criopresevación y posterior descongelación (Root 2010; Martí S, 2011).

Las dificultades en cuanto al envío, ya que requiere unos contenedores especiales de vapores de nitrógeno líquidos diseñados específicamente para este fin. Debido a ello se considera transporte de material peligroso, lo que conlleva cierta complejidad en lo que refiere los documentos necesarios, así como un elevado coste.

Como todo proceso de congelación seminal conlleva un marcado descenso en la calidad espermática, el nivel de éxito viene determinado por el grado de viabilidad que los espermatozoides conserven posteriormente a la congelación-descongelación. Por ello es sumamente importante informar bien a los propietarios sobre las limitaciones que este tipo de recursos seminales presenta, dejando siempre claro que los costes de compra, envío y conservación son elevados, el índice de éxito menor y el número de cachorros también.

En caso de seguir adelante, la compra del semen siempre debe hacerse bajo riguroso asesoramiento veterinario, asegurándonos un informe previo de calidad del semen posdescongelación para cerciorarse de que la compra merezca la pena y que el número de dosis que le venda a nuestro cliente sean suficientes. Esto es de vital importancia, ya que se establece que para que una reproductora pueda gestar tras inseminación con semen congelado debe usarse una dosis mínima de 200 millones de espermatozoides (Martí S, 2011). Por tanto, si la venta no llega a estos mínimos, debe ser descartada independientemente del proceso de inseminación artificial que se utilice.

Inseminación artificial canina

El depósito del semen en la perra o inseminación artificial (IA) se utilizan cada vez más sustituyendo a la monta natural principalmente para la prevención de la enfermedades de transmisión sexual, mejor manejo de los reproductores (nos permite comprobar la calidad del semen antes de depositarlo en la hembra) y para realizar cruces entre ejemplares situados en regiones lejanas a través del semen criopreservado. Además, se ha descrito que, si bien el número de inseminaciones no parece influir en la fertilidad, si esta se realiza en el periodo de fertilidad, realizar dos IA en el pico de fecundación (72 horas posovulación) aumenta la prolificidad (+1 cachorro de media) con semen fresco y congelado (vida <24h) (Levý X, 2014).

Las IA han evolucionado mucho en los últimos años y existen diversas técnicas. A groso modo podemos clasificar las inseminaciones en función del lugar de deposición del semen, vaginal o uterina (a nivel del cuerpo o cuernos).

El método de inseminación artificial más habitualmente utilizado en la clínica diaria es el inseminación vaginal dada su sencillez y necesidad de poco instrumental (vaina plástica tubular y jeringa estéril para inyectar el semen). Sin embargo, el uso de la sonda Osiris que consta de un balón para estimular las contracciones vaginales y evitar el reflujo seminal se aconseja para mejorar la efectividad de este tipo de IA (Martí S, 2011).

No obstante, el sistema de IA seleccionado es determinante a la hora de establecer el éxito del proceso de reproducción asistida, ya que la vagina y el cérvix uterino se presentan como los primeros obstáculos que deben sortear los espermatozoides en su camino a la fecundación. De hecho, se ha descrito que el número de espermatozoides necesarios para gestar si se deposita el semen directamente en vagina es diez veces mayor que si se hiciese en útero. Esto tiene máxima importancia si añadimos una baja calidad de semen como ocurre con el semen preservado en frío, especialmente el congelado. De hecho, la inseminación vaginal no se recomienda con semen refrigerado y está totalmente desaconsejado con semen congelado (Xavi Levy, 2014).

Para poner en práctica las IA a nivel del útero contamos con diferentes sistemas, de los que haremos un breve repaso a continuación.

Técnica noruega o escandinava

Este método es efectivo, pero requiere de un entrenamiento previo por parte del veterinario y un instrumental específico. Para ello se utiliza un catéter metálico con el que se pasa a través de un cilindro de plástico colocado a nivel vulvo-vaginal a modo de espéculo, hasta llevar a la zona del cérvix. Para ello nos ayudamos de la palpación abdominal intentando sujetar el cuello del útero que se toca como una estructura muscular circular en la región abdominal de la perra. A nivel práctico, tiene sus limitaciones en cuanto a su empleo en perras obesas y/o con pesos superiores a 20 kg y en el uso de semen procesado, ya que el semen quedaría en el cuello uterino. Es el método de elección para perras pequeñas (Fontbonne, 2008b) (figura 8).

Figura 8. Catéter metálico. Fuente: Fernando Mir Prieto, Clínica San Fernando, Mallorca.

Inseminación por videovaginoscopio

Esta técnica fue descrita por Wilson (2001) utilizando un endoscopio a través de la vagina para la visualización del cérvix uterino. Hay que introducir a través del mismo una cánula para intentar llegar a la región de los cuernos donde se depositará el semen (figura 9).

Figura 9. Detalle del cérvix uterino canulizado con la técnica endoscópica.

Para ello se necesita un endoscopio rígido con canal del trabajo por donde pasará un catéter urinario (5-6 Fr CRU uretral). Actualmente el sistema video-vaginoscopio rígido diseñado específicamente de Storz es el más utilizado ya que ha sido diseñado específicamente para ello, puesto que los endoscopios flexibles no son útiles dado el grosor. Además, durante el recorrido se aprovecha para evaluar bien la vagina y comprobar la ausencia de patologías (figura 10).

Figura 10. Endoscopio vaginal para inseminación artificial intrauterina.

La principal limitación es el entrenamiento y la familiarización con la endoscopia vaginal, el coste del equipo y su uso en razas pequeñas, si bien es el método de elección en perras de más de 10-15 kg de peso, por su efectividad, seguridad (y no doloroso) y permite la visualización por el propietario, lo que lo hace partícipe de la IA (Xavi Levy, 2014).

Técnica quirúrgica: laparotomía de línea media/laparoscopia

Esta técnica no necesita inversión ni aprendizaje ya que está basada en la deposición del semen en el extremo craneal de cada cuerno uterino mediante inyección directa en los mismos.

Se trata de un sistema controvertido debido a su nivel invasivo (anestesia general y cirugía abdominal), estando prohibida en algunos países, por lo que suele reservarse para hembras con infertilidad previa por otros métodos o si la calidad del semen es baja en cantidad o calidad (Root 2011; Xavi Levy, 2014).

Bibliografía disponible en www.argos.grupoasis.com/bibliografias/reproduccionasistida173.doc.

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