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ParaTBTools: Herramientas para el diagnóstico de la paratuberculosis


L. de Juan, E. Castellanos y A. Aranaz
Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) y Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense, Avda. Puerta de Hierro s/n 28040 Madrid.
Imágenes cedidas por los autores


La paratuberculosis, o enfermedad de Johne, es una enfermedad crónica granulomatosa que afecta al aparato digestivo de rumiantes domésticos, aunque la infección puede presentarse además en rumiantes y animales salvajes como ciervos, conejos y zorros. El agente etiológico está incluido en el complejo Mycobacterium avium y se denomina Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (M. a. paratuberculosis). El periodo de incubación del agente depende de la edad en el momento de la infección y de las dosis ingeridas, pero generalmente en ganado vacuno la aparición de los síntomas no se produce antes de los dos años de edad. La enfermedad se divide en cuatro estadios: fase latente (I), subclínica (II), clínica (III) y clínica en estado avanzado (IV). Esta enfermedad se caracteriza por lo que se denomina “efecto iceberg”: sólo un pequeño porcentaje de animales enfermos (15-25%) se detectan mediante las pruebas diagnósticas, es decir, solamente se detecta el pico del iceberg y en la explotación quedan muchos animales como falsos negativos. De hecho, se considera que por cada animal con un caso avanzado de paratuberculosis es probable que haya otros 25 animales infectados en la explotación.
El principal síntoma de la paratuberculosis es una pérdida crónica y progresiva de peso. En ganado vacuno, además se caracteriza por la presencia de una diarrea crónica intermitente. En las fases avanzadas de la enfermedad se presenta un edema intermandibular, emaciación, atrofia muscular, debilitación y muerte. En ganado vacuno se observa también una disminución en la producción láctea así como alteraciones de la fertilidad. En los pequeños rumiantes (ovejas y cabras) sólo un 10-20% de los casos clínicos presenta diarrea, y la pérdida crónica de peso es el síntoma característico. En las explotaciones los casos se presentan de forma esporádica o por goteo, debido al carácter crónico y progresivo de la enfermedad. Sin embargo, pueden existir concentraciones de casos clínicos en periodos determinados como la gestación, lactación, cambios de alimentación o de pastos, estrés debido al transporte o infecciones parasitarias o bacterianas.

Prevalencia
La paratuberculosis tiene una distribución mundial aunque la prevalencia real de la infección es difícil de determinar, ya que no es una enfermedad de declaración obligatoria en la mayoría de los países desarrollados y, por otra parte, la baja sensibilidad de las técnicas diagnósticas, la ausencia de signos clínicos patognomónicos y el largo periodo de incubación dificulta la detección de los animales infectados. Concretamente en España existe muy poca información respecto a la prevalencia de esta enfermedad, aunque los datos publicados indican que afecta tanto al ganado vacuno como a los pequeños rumiantes donde tiene una especial importancia. Las pérdidas económicas derivadas de esta enfermedad son cuantiosas y se deben tanto a causas directas (disminución de la producción láctea, mayor susceptibilidad a otras enfermedades, infertilidad, y disminución del valor de los animales en el matadero) como a causas indirectas e inaparentes (restricciones en el mercado ganadero, movimiento de los animales, instauración de medidas preventivas y pérdidas de potencial genético).

Posible zoonosis
Actualmente se está estudiando a M. a. paratuberculosis como posible agente etiológico de la enfermedad de Crohn (enfermedad inflamatoria crónica del intestino) que afecta al hombre, debido principalmente a la similitud clínica y patológica que presentan ambas enfermedades. Los síntomas clínicos de esta enfermedad son diarrea crónica, dolor abdominal, fiebre y pérdida de peso y se caracteriza por episodios de remisión y recaídas que en ocasiones requieren intervenciones quirúrgicas reduciendo drásticamente la calidad de vida del paciente. Se considera que la principal vía de transmisión de M. a. paratuberculosis de los animales al hombre podría ser el consumo de alimentos provenientes de animales infectados, y la leche cruda, pasteurizada o los productos lácteos (ej. queso fresco), son los alimentos de mayor riesgo para el consumidor. M. a. paratuberculosis se caracteriza por tener una elevada resistencia a condiciones térmicas extremas, de ahí que existan numerosos estudios sobre la resistencia térmica (ej. pasteurización) de M. a. paratuberculosis. Además, se han publicado aislamientos del agente en muestras de sangre de pacientes con la enfermedad de Crohn. A pesar de esta asociación que parece existir entre M. a. paratuberculosis y la enfermedad de Crohn, todavía se requieren más estudios para determinar su implicación y actualmente son numerosos los grupos de investigación que siguen estudiando este papel.

Principales objetivos del proyecto
1. Desarrollo y estandarización de nuevos reactivos y protocolos para el diagnóstico de paratuberculosis y la detección de M. a. paratuberculosis. Es decir, identificación y caracterización de nuevos antígenos y herramientas diagnósticas que permitan mejorar el diagnósticos de la paratuberculosis en el ganado y la detección del agente en heces, leche, sangre y tejidos.
2. Selección de nuevos antígenos específicos para el diagnóstico inmunológico de ganado infectado con M. a. paratuberculosis o sensibilizado con bacterias ambientales.
3. Desarrollo de técnicas de procesado y fabricación de leche y productos lácteos para garantizar la inactivación de M. a. paratuberculosis y estandarizar el cultivo y técnicas moleculares para la detección, aislamiento e identificación de M. a. paratuberculosis a partir de productos lácteos.
4. Establecimiento de estrategias de control que sean económicamente rentables para el ganado bovino, así como la evaluación cuantitativa y cualitativa del riesgo de la presencia de M. a. paratuberculosis en alimentos.
5. Investigación del papel de M. a. paratuberculosis en la patogenia de la enfermedad de Crohn y aplicación de nuevas herramientas para determinar si las cepas humanas son las mismas que las cepas que causan enfermedad en los animales.
6. Diseminación activa de los resultados del proyecto a consumidores, productores y administraciones.


Difícil diagnóstico
El diagnóstico de la paratuberculosis se puede realizar en el rebaño principalmente con pruebas de detección de la inmunidad humoral (inmunodifusión en gel de agar, fijación de complemento y prueba de inmunoabsorción enzimática o ELISA, que es la más extendida). Sin embargo, el diagnóstico bacteriológico es el más específico y debe emplearse siempre para la confirmación de la infección en un rebaño, ya que se considera como el método de referencia o gold standard. Las muestras de elección son la válvula ileocecal y el linfonodo ileocecal o, en caso de animales vivos, muestra fecal, aunque disminuye la sensibilidad ya que sólo detecta excretores y además la excreción no es continua. El periodo de incubación en el laboratorio es muy largo (incluso ocho meses) y algunas cepas de M. a. paratuberculosis (Tipo I y III) resultan más difíciles de cultivar, por lo que es muy importante la elección de los medios de cultivo más apropiados. La identificación se realiza principalmente mediante PCR dirigidas a secuencias genéticas específicas (IS900 y f57).

Anatomopatología
Mediante un diagnóstico anatomopatológico se puede observar una enteritis granulomatosa, caracterizada por un engrosamiento de los pliegues de la mucosa intestinal e hipertrofia de los linfonodos asociados. Histológicamente, la lesión más característica es un infiltrado celular formado por macrófagos, linfocitos y células epitelioides en la lámina propria intestinal que puede afectar a otras capas. Las lesiones pueden variar según el hospedador, el estado inmunológico de la especie animal, la fase y tiempo de infección, el tipo de cepa y las propias variaciones individuales de los aislados, y pueden ser desde lesiones focales a formas difusas. Sin embargo, hasta el momento las clasificaciones se han establecido en función de la naturaleza, localización, extensión y tipos celulares implicados en ganado bovino, ovino, caprino y animales salvajes (gamo).

Linfonodo mesentérico aumentado de tamaño.

Caracterización molecular
Las técnicas de caracterización molecular permiten analizar la diversidad genética de los aislados de M. a. paratuberculosis. Esto es muy importante desde el punto de vista epidemiológico para facilitar y asegurar el éxito de los programas y medidas de control de la paratuberculosis en las explotaciones. Los principales objetivos de la epidemiología molecular de esta enfermedad son:
- estudiar la existencia de aislados de M. a. paratuberculosis específicos de una determinada especie animal o localización geográfica; - establecer los reservorios de M. a. paratuberculosis tanto en animales domésticos como salvajes, así como en el medio ambiente para determinar su papel en el mantenimiento de la enfermedad y - estudiar la relación que existe entre los aislados de M. a. paratuberculosis a partir de animales, alimentos y pacientes de Crohn. Hay una variedad de técnicas moleculares que se pueden emplear para clasificar los aislados de M. a. paratuberculosis [análisis de los polimorfismos genéticos en la secuencia de inserción IS900 (IS900-RFLP), electroforesis en campo pulsado (PFGE) y técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)]. Toda ellas clasifican los aislados de M. a. paratuberculosis en tres grandes grupos: grupo bovino o Tipo II, grupo ovino o Tipo I y grupo intermedio o Tipo III.

Programas de control
Los programas de control frente a esta enfermedad se basan en la valoración de los riesgos, el establecimiento de pautas de control específicas dependiendo del tipo de explotación, especie animal y grado de infección, y la formación del personal que lleva a cabo el programa de control. La mayoría de los programas de control tienen como principales objetivos:
- reducir las pérdidas económicas;
- mejorar las condiciones de los rebaños infectados;
- disminuir la excreción de M. a. paratuberculosis en el medio ambiente;
- romper la cadena de transmisión en los animales recién nacidos;
- disminuir el riesgo de M. a. paratuberculosis en los productos animales y
- proteger a los rebaños no infectados o de bajo riesgo.
Sin embargo, existen diversos factores que afectan al desarrollo de los programas de control como el tipo de producción (sistema intensivo), inadecuadas herramientas diagnósticas para la identificación de los animales infectados, mezcla de leche o calostro de animales infectados, importación de animales procedentes de explotaciones con paratuberculosis, malas pautas de manejo, etc.

Vacunación
Otra forma de control de la paratuberculosis es la vacunación de los animales. Actualmente, existen vacunas comerciales vivas e inactivadas que se administran subcutáneamente durante el primer mes de vida para proteger al animal antes de que se produzca la infección o impedir la progresión de la misma si el animal ya está infectado. Las principales consecuencias que se obtienen al aplicar un programa de vacunación en una explotación son la disminución del número de animales con sintomatología clínica, la disminución del número de animales con lesiones intestinales o positivos a cultivos bacteriológicos y, por último, la reducción del número de excretores fecales lo que repercute directamente en el nivel de contaminación ambiental. A pesar de las ventajas aparentes que tiene el uso de la vacunación, existen una serie de efectos negativos asociados a la misma:
- 1. A pesar de que la vacunación induce una respuesta humoral y celular, ésta no confiere una protección absoluta por lo que los animales vacunados no eliminan completamente la infección y pueden desarrollar la enfermedad y/o excretar M. a. paratuberculosis con las heces.
- 2. Desarrollo de nódulos fibrocaseosos en el punto de inoculación debido a una fuerte respuesta inflamatoria por parte de los animales.
- 3. Interferencia diagnóstica con las pruebas serológicas para el diagnóstico de la paratuberculosis y con las pruebas oficiales de diagnóstico frente a la tuberculosis. Debido a esto la vacunación de ganado vacuno está prohibida en países que tengan un programa de erradicación de la tuberculosis bovina.


En las explotaciones, los casos se presentan de forma esporádica o por goteo, debido al carácter
crónico y progresivo de la enfermedad.

Proyecto europeo de investigación
Debido a la importancia que tiene esta enfermedad y la dificultad que existe para su control y/o erradicación, se creó un consorcio de grupos de investigación para su participación en un proyecto europeo. Este proyecto titulado “Desarrollo de herramientas para la detección de paratuberculosis en el ganado, M. paratuberculosis en los alimentos y evaluación del riesgo para el hombre” está formado por 28 instituciones de siete países europeos (Holanda, Reino Unido, Noruega, España, República Checa, Dinamarca, Bélgica) y de cuatro países no europeos (Estados Unidos, Nueva Zelanda, Canadá y Argentina). Además, el consorcio incluye dos compañías que se dedican a la comercialización y desarrollo de metodología para el diagnóstico de paratuberculosis (Adiagene e ID-VET). La página web de este proyecto es www.ucm.es/info/paratbtools.
Este proyecto comenzó en junio del 2006 y anualmente se realizan reuniones donde cada socio presenta los resultados obtenidos en las distintas áreas temáticas del proyecto:
- Área temática 1: estandarización, armonización y optimización de las técnicas de laboratorio para el diagnóstico de paratuberculosis en el ganado.
- Área temática 2: interacción hospedador y patógeno en rumiantes infectados con micobacterias.
- Área temática 3: inactivación de M. a. paratuberculosis en leche y productos lácteos.
- Área temática 4: control y riesgo.
- Área temática 5: estudio y caracterización de la interacción entre pacientes de Crohn y M. a. paratuberculosis.
Una vez finalizado el proyecto se emitirá un informe final donde se recogerán los resultados globales del estudio. Estos resultados se diseminarán tanto al público en general mediante revistas de divulgación como a la comunidad científica en revistas de investigación. Gracias a la formación de este grupo de investigadores, se ha creado un consorcio de profesionales y veterinarios con experiencia que se mantendrá más allá de la duración de este proyecto de investigación.

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