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Tipificación molecular de Brucella y aplicación de la PCR al diagnóstico de la brucelosis

Premio Syva 2010 a la mejor tesis doctoral en Sanidad Animal


David García Yoldi e Ignacio López-Goñi. Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad de Navarra (Pamplona).

Brucella es el agente causante de la brucelosis, una enfermedad del ganado que también afecta al hombre. El rango de hospedador es muy amplio e incluye animales domésticos y salvajes, como rumiantes, cerdos, perros, renos, mamíferos marinos y roedores. Tradicionalmente se ha considerado que el género Brucella estaba dividido en seis especies:

  • B. abortus, aislada principalmente del ganado bovino;
  • B. melitensis, de cabras y ovejas;
  • B. ovis, de carneros;
  • B. suis, de cerdos y jabalíes;
  • B. canis, de perros;
  • y B. neotomae, de roedores.

Recientemente se han propuesto tres nuevas especies de Brucella: B. ceti y B. pinnipedialis, de aislamientos de cetáceos y pinnípedos marinos, respectivamente; y B. microti, a partir de Microtus arvalis, comúnmente denominado topillo campestre.
B. melitensis, B. abortus, B. suis y B. canis son las especies más importantes que pueden afectar al ser humano, siendo en este orden las más patógenas B. melitensis, B. abortus y B. suis.

Un problema de salud pública de primer orden
Desde el punto de vista sanitario, la brucelosis representa un problema de primer orden: es una de las cinco zoonosis bacterianas más comunes en el mundo, con alta prevalencia en África, Asia, Latinoamérica y los países del área mediterránea. Además, genera graves pérdidas económicas por aborto e infertilidad en el ganado, especialmente en el vacuno, con una mayor incidencia de la enfermedad que en el ganado ovino y caprino.
En los animales infectados, las bacterias son excretadas durante el aborto o el parto, encontrándose en grandes cantidades en el calostro y la leche, en el exudado vaginal y en los órganos del feto abortado. Los seres humanos adquieren la brucelosis a partir de animales domésticos y no son por ellos mismos un foco de contagio. La infección se puede adquirir de forma directa, por contacto con animales a través de heridas y por vía conjuntival o inhalación; o de forma indirecta por ingestión de productos contaminados, leche y sus derivados.
La brucelosis humana es una enfermedad grave y debilitante que requiere una terapia antibiótica larga y costosa, y que a menudo deja secuelas permanentes. Está considerada como enfermedad profesional en aquellas ocupaciones relacionadas con el contacto con los animales.
Según la OMS la brucelosis es una de las siete zoonosis “olvidadas”, un grupo de enfermedades que afecta de manera importante al desarrollo de muchas zonas del planeta. Más del 70% de todo el ganado mundial (entre cabras, ovejas, vacuno y porcino) se encuentra en países en vías de desarrollados, donde los servicios de salud animal o humano escasean o sencillamente no existen. Este hecho dificulta la erradicación de la brucelosis en muchos países. Como la economía de estas zonas depende principalmente de la actividad ganadera, esta enfermedad contribuye al mantenimiento de la pobreza y el subdesarrollo.

PCR para detección y tipificación de la bacteria
La vacunación de los animales y el diagnóstico de la brucelosis siguen siendo esenciales para el control de la enfermedad. El objetivo principal de nuestro trabajo ha sido el desarrollar y evaluar nuevas técnicas moleculares para la detección y tipificación de la bacteria Brucella al nivel de especie, biovariedad y cepa. Estos estudios facilitan el diagnóstico de la infección y permiten hacer estudios epidemiológicos más precisos, contribuyendo por tanto al control de la enfermedad.
En concreto, hemos empleado varias técnicas de amplificación génica derivadas de los que se conoce como PCR, o reacciones de polimerasa en cadena. Actualmente ya se conoce el genoma completo de varias especies de Brucella, datos que hemos empleado en nuestro trabajo. Su estudio nos ha permitido seleccionar algunas secuencias de ADN muy conservadas que nos permiten la detección específica de la bacteria.
Por otro lado, hemos analizado los polimorfismos o diferencias genéticas entre las especies y biovariedades de Brucella, y hemos seleccionado un panel de marcadores moleculares -basados en inserciones, deleciones, mutaciones puntuales y secuencias repetidas- para la discriminación entre las distintas brucelas. Así, hemos desarrollado una nueva técnica de PCR múltiple (denominada Bruce-ladder) capaz de discriminar o diferenciar entre todas las especies de Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis y B. neotomae), incluidas los aislamientos de mamíferos marinos (B. ceti y B. pinnipedialis), y las cepas que se emplean como vacunas B. abortus RB51, B. abortus B19 y B. melitensis Rev1 (figura 1).

Figura 1. Resultado de la PCR Bruce-ladder: (m), Brucella de aislamientos marinos; (M), B. melitensis; (Rev1), B. melitensis Rev1; (O), B. ovis; (A), B. abortus; (RB51), B. abortus RB51; (B19), B. abortus B19; (S), B. suis; (C), B. canis; (Neo), B. neotomae. Los números indican el peso molecular de los fragmentos amplificados. Con flechas blancas se indican las diferencias entre especies. Cada especie o cepa vacunal presenta un perfil característico que permite su diferenciación mediante una PCR convencional.


Este ensayo, que se realiza en un solo paso, permite saber qué tipo de brucela causa la infección. La técnica ha sido evaluada en siete laboratorios europeos con más de 600 cepas de Brucella de origen animal y humano y de distinta procedencia geográfica. Se puede realizar en menos de 24 horas, en cualquier laboratorio de diagnóstico básico, sustituye a las técnicas biológicas y bioquímicas clásicas y evita la excesiva manipulación de este importante patógeno.
Esta técnica ha sido reconocida y recomendada por la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) en su último “Manual de brucelosis bovina” para la tipificación molecular de Brucella, sustituyendo a otras como la PCR-AMOS.
Se ha desarrollado también un ensayo de PCR a tiempo real que permite la detección específica de todas las especies y biovariedades del género Brucella con una sensibilidad de 100 fg de ADN y una especificidad del 100%. Un ensayo similar pero de PCR a tiempo real múltiple permite la diferenciación específica en una sola reacción de B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. ovis. La empresa española de biotecnología veterinaria Ingenasa ha desarrollado varios kits comerciales de diagnóstico y tipificación basados en estas técnicas (figura 2).

Figura 2. Detección de ADN de B. abortus mediante PCR a tiempo real. En colaboración con la empresa española de biotecnología veterinaria Ingenasa se han desarrollado varios kits comerciales de PCR a tiempo real para la detección de Brucella y la diferenciación específica en una sola reacción de B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. ovis.


Otro aspecto de nuestro trabajo estaba dirigido a la aplicación de técnicas moleculares que permiten discriminar a nivel genético entre cepas de la misma bacteria, lo que se conoce como MLVA (de forma coloquial podríamos definir estas técnicas como “pruebas de paternidad” pero aplicadas a los microorganismos).

Aplicación para analizar la estabilidad genética de la cepa Rev 1
Estas técnicas las hemos empleado en dos problemas concretos. Por una parte, para analizar la estabilidad genética de la cepa vacunal B. melitensis Rev1.
Este aspecto es muy importante, porque para el control de la brucelosis se emplean vacunas vivas y es esencial que estas sean estables e idénticas independientemente del origen geográfico, comercial o tipo de aislamiento. En nuestro trabajo hemos demostrado que esta técnica se puede emplear para garantizar la calidad y estabilidad de esta vacuna.

Lucha contra la creciente presencia en Europa de brucelosis porcina
Otro problema concreto que hemos abordado está relacionado con la infección por B. suis, el agente causal de la brucelosis porcina. Esta especie está clasificada en cinco biovariedades que infectan de manera preferencial a distintas especies animales: las biovariedades 1 y 3 afectan a cerdos domésticos y jabalíes, la biovariedad 2 afecta también a liebres, la 4 principalmente a renos y la 5 a roedores. La biovariedad 2, a diferencia de las 1 y 3, raramente se aísla de humanos y su papel zoonotico se ha cuestionado.
En algunas granjas porcinas europeas se ha detectado un aumento de brotes de brucelosis. El diagnóstico y la tipificación correctas son esenciales para llevar a cabo estudios epidemiológicos que permitan el control y la erradicación de la infección por B. suis. Nuestros resultados con aislamientos de B. suis demuestran una perfecta correlación entre las pruebas moleculares y otras técnicas, siendo capaces de demostrar la existencia de brotes epidemiológicos y confirmar la infección cruzada de B. suis entre animales salvajes (jabalíes) y domésticos (cerdos) (figura 3).

Figura 3. Ejemplo de análisis molecular por MLVA de aislamientos de B. suis. Los recuadros en rojo señalan una posible infección cruzada de B. suis entre jabalíes y cerdos domésticos en un caso (a), y la existencia de brotes epidemiológicos en el otro (b).

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