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Jennifer Toskano¹, José Ignacio Núñez¹ y Natàlia Majó^1,2
1IRTA-CReSA
²Dpto. de Sanitat i Anatomia Animals, Facultad de Veterinaria
Universitat Autònoma de Barcelona

La bursitis infecciosa (IBD) es una enfermedad viral altamente contagiosa de las aves jóvenes caracterizada por la inflamación y posterior atrofia de la bolsa de Fabricio. Esta enfermedad se considera como una de las más importantes dentro del sector avícola debido a las cuantiosas pérdidas económicas que ocasiona tanto por acción directa de la enfermedad como por los efectos inmunosupresores de la misma.

Lesión microscópica de la IBD.

Identificación genómica

Debido a la naturaleza de su genoma, el virus de la IBD (IBDV) posee un alto potencial de variación genética, lo que le permite evolucionar y adaptarse a nuevas condiciones ambientales o áreas geográficas. Así, desde su primera descripción a inicios de los años 60 en los Estados Unidos, el IBDV se ha ido diversificando hasta dar lugar a cepas altamente virulentas, que a día de hoy están presentes en casi todo el mundo.

Con estos antecedentes y el objetivo de tener una aproximación acerca de la diversidad de los IBDV circulantes en España, se analizaron inicialmente 968 secuencias genómicas de IBDV provenientes de pollos de engorde y gallinas de puesta procedentes de diferentes regiones del país. La caracterización genética se basó en el análisis de un fragmento de 480 pb de la región hipervariable (RHV) de la proteína VP2 obtenido a partir de muestras que se remitieron al laboratorio entre los años 2000 y 2015. La identificación se llevó a cabo empleando las técnicas moleculares de reacción en cadena de la polimerasa y transcriptasa reversa (RT-PCR), seguida de la secuenciación y el análisis filogenético, junto con secuencias de virus de referencia publicadas en la base de datos de secuencias génicas.

El virus desde el punto de vista molecular

El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) es un birnavirus que se caracteriza por poseer un genoma de doble cadena de ARN bisegmentado (segmentos A y B). El segmento A contiene los genes que codifican una poliproteína que se autoprocesa para dar origen a las proteínas maduras VP2 y VP3, que forman la cápside del virus, y VP4, que desempeña funciones enzimáticas. También contiene un gen que codifica la proteína VP5, más pequeña, no estructural e involucrada en la replicación viral. El segmento B codifica la proteína VP1, que corresponde a la polimerasa viral (figura 1). La mayoría de técnicas moleculares que permiten detectar IBDV se basan en la localización del gen que codifica la proteína VP2. Esta es la proteína más expuesta y contiene una región hipervariable (RHV) que alberga aminoácidos implicados en la virulencia, así como los epítopos implicados en la producción de anticuerpos neutralizantes (Coulibaly et al., 2005).

Los resultados indicaron que las cepas muy virulentas responsables de los brotes agudos de los años 90 permanecían circulando entre los años 2000 y 2015, aunque el número de casos disminuía a medida que pasaba el tiempo. Por el contrario, la detección de virus clásicos atenuados muy similares a los virus vacunales, utilizados con más frecuencia en la inmunización de las aves, fue incrementando hasta el punto de suponer más del 80 % de los virus diagnosticados por PCR y por secuenciación en los últimos años. Esto es, en nuestra opinión, un indicador de una disminución de los casos agudos de campo y, por lo tanto, una mejora en el control de la enfermedad.

Por otro lado, contar con un amplio número de secuencias representativas de distintas localizaciones y recogidas en tiempos distintos, permitió tener una imagen más exacta de las diversas cepas de IBDV que han estado circulando durante estos últimos años. De esta manera, se demostró que aparte de los IBDV muy virulentos y de las cepas clásicas atenuadas, existían dos nuevos grupos de IBDV que habían estado circulado en España durante estos últimos años (figura 2). Uno de los nuevos grupos de cepas estaba estrechamente relacionado (100 % de similitud) con la cepa V877 (virus vacunal que se utiliza ampliamente en países donde la infección por cepas muy virulentas presenta grandes problemas, pero que nunca antes se había detectado en España), y un segundo nuevo linaje, que en el estudio se denomina IBDV/Sp-var, representaba el 1,8 % de los virus caracterizados. Algunos de los virus de este nuevo linaje databan del año 2002, lo que sugiere que este nuevo linaje estaba circulando desde hacía varios años, probablemente sin estar asociado a una sintomatología concreta que llevara a la sospecha de infección por IBDV y, por ende, se trataba de cepas que no fueron detectadas frecuentemente en el laboratorio. Sin embargo, la secuencia aminoacídica mostró mutaciones implicadas en el tropismo celular, la virulencia y la variación antigénica; además, poseía residuos particulares que hacía que las cepas se agruparan independientemente. Estos cambios genéticos podrían ser responsables de un perfil antigénico distinto, una teoría que sería necesario confirmar con técnicas que precisan del uso de anticuerpos monoclonales.

Difusión del virus

La reconstrucción filogeográfica permitió explicar y visualizar la dinámica en el tiempo y el espacio de los linajes virales presentes en el país. El análisis determinó que las cepas muy virulentas se dispersaron en el territorio español alrededor de los años 90 y que del 2002 al 2004 se generó una gran diversidad genética que se distribuyó en el tiempo de una forma heterogénea, con más presencia en la región oriental del país. Mientras tanto, el análisis del linaje IBDV/Sp-var mostró que se originó alrededor del año 1995 y se dispersó fundamentalmente en la región oriental de España. En el caso de las cepas muy virulentas, la rápida diseminación de este linaje en un periodo corto se pudo deber a varios factores; entre ellos la ineficiente inmunización por falta de biológicos adecuados en ese momento, el movimiento de aves de corral y, quizá, los desplazamientos de aves salvajes.

Un resultado interesante de los estudios de filodinámica de los virus muy virulentos fue el relacionado con el origen de estas cepas. En España, inicialmente se pensaba que la enfermedad aguda emergía por introducción de las cepas muy virulentas procedentes de los Países Bajos a finales de los 80. Sin embargo, el análisis de la distribución filogeográfica para estas cepas muy virulentas españolas determinó que tenían origen en Oriente Próximo, como sucede con las cepas originarias de los Países Bajos, y que habían evolucionado en estas dos regiones de forma paralela e independiente (figura 3A).

Figura 3A. Dinámica de difusión en el tiempo y el espacio de las cepas de IBDV muy virulentas. Difusión del linaje IBDV muy virulento en España. Este linaje se disemina de forma heterogénea, con mayor difusión en la zona este y con focos de dispersión más intensos hacia el sur y norte del país. Los resultados fueron visualizados usando las bases de Google Earth.

Teniendo en cuenta que estas cepas llegaron a España años después, una explicación probable es que su llegada se diera a través de las rutas de aves migratorias, tal y como ha ocurrido con la expansión de otros virus como el de la gripe aviar, si se considera que las tres rutas aéreas más importantes de aves migratorias cubren Asia y Europa y cruzan por Irán (Jeon et al., 2008), aunque no existe información acerca de si el IBDV es capaz de infectar las especies de aves que circulan en estas rutas euroasiáticas (figura 3B).

Figura 3B. Dinámica de difusión en el tiempo y el espacio de las cepas de IBDV muy virulentas. Difusión entre Asia y Europa. Se muestra la introducción del virus a Europa desde Irán, estimando que el ingreso del virus en España data de 1991. Los resultados fueron visualizados usando las bases de Google Earth.

Curiosamente, el aumento de la diversidad genética tanto de los IBDV muy virulentos como de los virus clásicos atenuados alcanzó un valor máximo hacia los años 2002-2004, lo que podría coincidir con la introducción en campo y adaptación de los virus vacunales intermedios. Este hecho influyó considerablemente en la disminución de la variabilidad del linaje muy virulento, lo que indicaría que la introducción de virus vacunales de tipo intermedio ayudó a controlar la diversidad en campo de las cepas muy virulentas en España, pero influyó en el incremento en la diversidad del linaje clásico atenuado. Este hecho podría ser indicativo de que la adaptación y posterior divergencia de los virus atenuados introducidos habían contribuido a la emergencia del nuevo linaje IBDV/Sp-var, como un linaje de escape a la vacunación aplicada en España.

Relación entre cepas

Toda esta información basada en VP2, llevó a pensar en la posibilidad de que otras regiones del virus también se vieran afectadas por estos cambios de adaptación que se generan para la subsistencia del virus. Finalmente, la afirmación de diversos estudios moleculares del IBDV de que la virulencia no solo reside en la VP2 (Nouen et al., 2012), junto con los hallazgos antes mencionados, llevó a plantear la caracterización molecular de los segmentos completos A y B de 16 cepas IBDV muy virulentas españolas, detectadas en diferentes años y lugares. Estas cepas fueron comparadas con otras cepas muy virulentas descritas en otros países, cepas clásicas y atenuadas, así como con cepas vacunales (datos extraídos del banco de genes). Las secuencias fueron obtenidas mediante su amplificación por PCR específicas y el posterior clonaje de ambos segmentos. El análisis global de las cepas en cuestión definió que el linaje muy virulento y clásico atenuado se agrupan con sus similares tanto en el análisis del segmento A como en el segmento B y en general permanecen muy conservados.

La comparación de los árboles filogenéticos obtenidos a partir de las secuencias de los segmentos A y B no identificó posibles casos de reordenamientos genómicos; esto es, la aparición de nuevos virus que contienen segmentos pertenecientes a dos virus distintos después de infectar ambos a un mismo animal. Este hecho parece indicar un comportamiento evolutivo diferente, contrariamente a lo descrito en otras regiones del mundo, como China, donde la detección de virus con los segmentos A y B reordenados parece ser más frecuente (He et al., 2014).

Mediante el estudio de recombinación se detectó la presencia de un virus recombinante, condición que consiste en el intercambio de material genético entre dos virus dentro de un mismo segmento. Este virus tenía como ascendencia mayor un virus muy virulento y el fragmento de nucleótidos incorporado tenía como ascendencia menor la cepa vacunal GM97. Si bien eventos recombinantes han sido descritos en RHV, esta fue la primera vez que se describió recombinación en la proteína VP3, la cual, aun cuando no participa en la interacción antígeno anticuerpo, está implicada junto con la VP1 en la replicación viral.

Varios de los resultados expuestos en este trabajo ayudan a esclarecer el comportamiento del IBDV en el país. Para este tipo de estudios, disponer de un número elevado de secuencias completas resulta primordial. Una de las aportaciones más relevantes de este estudio es el incremento de información de secuencias de IBDV en las bases de datos que podrán ser empleadas en nuevos trabajos. Esto permitirá detectar en un futuro eventos de recombinación o reordenamientos y posiblemente observar cambios que se puedan asociar a la virulencia o patogenicidad de IBDV.

Bibliografía

Coulibaly, F., Chevalier, C., Gutsche, I., Pous, J., Navaza, J., Bressanelli, S., Delmas, B. and Rey, F. A. (2005). The birnavirus crystal structure reveals structural relationships among icosahedral viruses. Cell, 120, 761-772.
He, X., Xiong, Z., Yang, L., Guan, D., Yang, X. and Wei, P. (2014). Molecular epidemiology studies on partial sequences of both genome segments reveal that reassortant infectious bursal disease viruses were dominantly prevalent in southern China during 2000-2012. Arch Virol, 159, 3279-3292.
Jeon, W. J., Lee, E. K., Joh, S. J., Kwon, J. H., Yang, C. B., Yoon, Y. S. and Choi, K. S. (2008). Very virulent infectious bursal disease virus isolated from wild birds in Korea: epidemiological implications. Virus Res, 137, 153-156.
Le Nouen, C., Toquin, D., Muller, H., Raue, R., Kean, K. M., Langlois, P., Cherbonnel, M. and Eterradossi, N. (2012). Different domains of the ARN polymerase of infectious bursal disease virus contribute to virulence. PLoS One, 7, e28064.