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Cristina A. Martínez, Emilio Martínez y María A. Gil
Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Universidad de Murcia. 30100 Murcia. España
Imágenes cedidas por los autores

Artículo publicado en la revista Suis nº 133. Entra en nuestra tienda online y escoge la modalidad de suscripción a Suis que más te guste.

El principal reto de la industria porcina es optimizar la producción de carne de cerdo y al mismo tiempo garantizar la sostenibilidad y un coste eficiente. Por ello, el sector porcino exige cada día más esfuerzos para aumentar los rendimientos productivos y la competitividad nacional e internacional. Estos esfuerzos se traducen en una mayor tecnificación de las explotaciones para poder hacer frente a las demandas del mercado. En este sentido, el empleo de tecnologías reproductivas innovadoras ocupa un lugar destacado en la planificación a corto, medio y largo plazo de las empresas del sector. Entre estas tecnologías cabe destacar la transferencia de embriones (TE) que, pese a ser demandada por el sector desde hace más de medio siglo, todavía no se ha implementado debido a las dificultades técnicas que se han encontrado durante su desarrollo.

La utilización comercial de la TE aportaría indudables beneficios para el sector porcino, tanto en las empresas de genética productoras de los embriones como en las receptoras de los mismos. Algunos de los beneficios que comportaría el uso de la TE en las empresas de genética serían los siguientes:

• Abastecimiento de animales (en forma de embriones) de alto nivel genético, directamente desde los núcleos de selección de las empresas de genética a los núcleos cerrados de los clientes, sin limitaciones de tipo temporal y con las máximas garantías sanitarias.
• Eliminación del transporte de animales vivos. Esto evitaría problemas asociados con el bienestar animal y reduciría el coste del transporte.
• En el caso de utilizar técnicas de criopreservación embrionaria se podría conservar de manera indefinida el material genético de una empresa, algo que puede ser fundamental ante eventuales crisis sanitarias.

Por su parte, las empresas receptoras de los embriones se beneficiarían en los siguientes aspectos:

• Utilización del material genético con la máxima calidad sanitaria.
• Reducción de costes relacionados con la adaptación de los animales a sus explotaciones.
• Reducción del retraso genético respecto a los núcleos de selección.
• Simplificación de la gestión genética de los animales presentes en sus núcleos de selección o multiplicación.

Pese a la trascendencia de dichas aplicaciones comerciales, durante décadas el empleo de la TE en la especie porcina ha sido prácticamente una utopía, debido fundamentalmente a dos factores: (I) la necesidad de emplear técnicas quirúrgicas para la deposición de los embriones en las hembras receptoras; (y II) los problemas encontrados para conservar los embriones de esta especie. Sin embargo, la situación ha cambiado radicalmente en la última década y hoy en día se dispone de una tecnología para transferir los embriones por vía no quirúrgica, además de procedimientos para la conservación de los embriones a corto y largo plazo.

Desarrollo de un procedimiento para transferir los embriones por vía no quirúrgica

Después del primer intento sin éxito para transferir embriones por vía no quirúrgica (Polge y Day, 1968), esta técnica se consideró imposible durante muchos años. El principal problema para introducir un catéter en el interior del tracto genital de una cerda radicaba en la compleja anatomía del conducto cervical y la longitud y sinuosidad de los cuernos uterinos (figura 1).

Aunque en la década de los 90 se desarrollaron algunos procedimientos para transferir embriones por vía no quirúrgica, ninguno de ellos ofreció resultados prometedores de fertilidad y prolificidad (Hazeleger y Kemp 2001; Martínez y cols., 2001a). En todos esos procedimientos se logró superar el conducto cervical y transferir los embriones no más allá del cuerpo del útero. No obstante, el cuerpo uterino de la cerda no es el lugar más apropiado para depositar los embriones, ya que las tasas de gestación son muy inferiores (12 %) a cuando los embriones se depositan en la parte media (88 %) o en el tercio anterior (82 %) de un cuerno uterino (figura 2; Wallenhorst y Holtz, 1999).

Por ello, era necesario desarrollar un nuevo procedimiento para transferir los embriones en la profundidad de un cuerno uterino. Básicamente, se necesitaba disponer de un catéter con la fuerza de propulsión suficiente para atravesar el conducto cervical, y la flexibilidad adecuada para progresar a lo largo de un cuerno uterino sin perforar su pared. En el año 2000 nuestro grupo de investigación de la Universidad de Murcia desarrolló un sistema para la cateterización intrauterina profunda en la especie porcina sin sedar a las cerdas y sin perturbar su bienestar (figura 3; Martínez y cols., 2001 a, b).

Con este sistema es posible atravesar el conducto cervical y alcanzar la profundidad de un cuerno uterino en el 90 % de las cerdas receptoras, en menos de cinco minutos, a los 4-6 días después del comienzo del estro (Martínez y cols., 2005). Las receptoras toleran bien el procedimiento (más del 90 % no presentan ningún tipo de reacción durante la inserción del catéter) y el uso de medidas asépticas previene la presencia de infecciones uterinas postransferencia. Los resultados obtenidos hasta el momento indican que este nuevo sistema puede utilizarse de forma sencilla, económica y práctica para la TE por vía no quirúrgica en la especie porcina.

En los primeros ensayos con esta técnica se obtuvieron índices aceptables de fertilidad y prolificidad (75 % y 7 lechones nacidos; Martínez y cols., 2004). Con las mejoras introducidas en el procedimiento, dichos resultados se han incrementado sustancialmente (80 % y 9,5 lechones nacidos; Ángel y cols., 2014a, b), incluso con el empleo de embriones conservados in vitro durante 24 h (Martínez y cols., 2014) o vitrificados (Martínez y cols., 2015).

Factores que afectan a la eficiencia de la transferencia no quirúrgica de embriones frescos

Recientemente se ha evaluado el efecto de diferentes factores que afectan la eficiencia final de la transferencia no quirúrgica de embriones y por tanto a las posibilidades de la implementación de esta técnica a nivel comercial. Entre dichos factores destacan la superovulación de las cerdas donantes y el grado de sincronía entre donantes y receptoras.

Teniendo en cuenta la tasa de ovulación normal en la cerda (15-25 ovocitos) y el número de embriones necesarios por transferencia quirúrgica (15-23 embriones; Polge, 1982; Cameron y cols., 1989) o no quirúrgica (24-30 embriones; Hazeleger y cols., 2000; Martínez y cols., 2004), se podría estimar que la proporción teórica donante:receptora es de 1:1. Sin embargo, en la práctica existen varios factores que establecen el número final de embriones obtenidos por cerda donante: las tasas de gestación y de fecundación, el estadio de desarrollo embrionario, la calidad embrionaria o las tasas de recuperación. Estos factores determinan que normalmente se necesiten entre 2 y 2,5 cerdas donantes por cada receptora. Una posibilidad para disminuir esa proporción es superovular las cerdas donantes con gonadotrofina coriónica equina (eCG). Para ello, las cerdas donantes se tratan con 1.000 UI de eCG a las 24 h del destete. A las cerdas que muestran síntomas de estro a las 48-72 h tras la administración de eCG se les administran 750 UI de gonadotrofina coriónica humana (hCG) al inicio del estro, se inseminan dos veces y sobre el día 5 o 6 (el día 0 es el inicio del estro) del ciclo se someten a una laparotomía para obtener mórulas o blastocistos, respectivamente (figuras 4 y 5).

Con este protocolo de superovulación, en cerdas de raza pura Duroc se ha conseguido incrementar significativamente el número total de cuerpos lúteos, embriones y embriones transferibles sin afectar a los porcentajes de ovocitos no fecundados o embriones degenerados, en comparación con el grupo control (cerdas no superovuladas; Ángel y cols., 2014a). Recientemente se han publicado resultados similares utilizando otras razas (Pietrain) o líneas (Landrace-Large White) porcinas (Cuello y cols., 2016a) (figura 6). Además, la fertilidad y prolificidad tras la transferencia no quirúrgica fueron similares entre los embriones control (72,7 % y 9,0 ± 0,9 lechones nacidos) y los superovulados (73,3 % y 9,3 ± 1,2 lechones nacidos) (Ángel y cols., 2014a). Todos estos resultados indican que el número de donantes por receptora puede disminuirse mediante la utilización de protocolos de superovulación. Asimismo, se ha comprobado que la eficiencia de la superovulación no se ve afectada por el número de partos de la donante (entre dos y siete), la estación del año (otoño, invierno y primavera) o por el intervalo destete-estro (3 o 4 días). Estas observaciones son sumamente importantes, ya que la posibilidad de utilizar cerdas donantes con un amplio rango de partos y durante un periodo prolongado simplifica notablemente la aplicación de los programas de TE en los núcleos de donantes.

Otro factor que se ha evaluado es el efecto de la sincronía entre donantes y receptoras sobre los resultados reproductivos de las cerdas receptoras tras la TE (Ángel y cols., 2014b). En ese estudio se obtuvieron tasas bajas de gestación cuando las receptoras comenzaron el estro 24 h antes (-24 h) que las donantes. Los mejores resultados de gestación y parto se alcanzaron con receptoras que iniciaron el estro 24 h después (+24 h) que las donantes. Cuando los resultados de ese experimento se analizaron según el estadio embrionario transferido, una asincronía de +24 h fue adecuada tanto para mórulas como para blastocistos. Sin embargo, una asincronía de +48 h fue apropiada para transferencias realizadas con blastocistos pero no con mórulas, probablemente porque en este último caso las receptoras se encuentran en el día 3 del ciclo y algunas de ellas están todavía en celo (Ángel y cols., 2014b).

Transferencia no quirúrgica con embriones preservados

En la actualidad se pueden utilizar dos sistemas de conservación de embriones para su posterior transferencia a las receptoras: (I) la preservación embrionaria en estado líquido durante un periodo reducido de tiempo; (y II) la criopreservación indefinida de los embriones mediante vitrificación.

Transferencia no quirúrgica con embriones conservados en estado líquido

El método de conservación de los embriones en estado líquido durante pequeños periodos de tiempo es el cultivo in vitro, lo que implica que los embriones continúan su desarrollo. En este punto es importante resaltar que, por razones sanitarias, durante el transporte y la transferencia los embriones deben estar rodeados por una zona pelúcida intacta. Esta estructura les protege de contaminantes patógenos y garantiza su transporte con el mínimo riesgo de transmisión de enfermedades. Por tanto, el estadio más apropiado para la TE comercial se limita al de mórula o blastocisto no eclosionado, ya que estadios más tempranos de desarrollo deben transferirse en el oviducto y no se pueden utilizar para transferencia uterinas.

Se sabe que un periodo de 6 h entre la obtención de los embriones y su transferencia no perjudica la supervivencia in vitro e in vivo de los mismos, y que se pueden obtener unos resultados satisfactorios de gestación y parto (Martínez y cols., 2004; Ángel y cols., 2014a,b). Este tiempo es suficiente cuando las cerdas receptoras se encuentran en un lugar próximo a las hembras donantes.

En algunos casos, un periodo de 24 h entre la obtención de los embriones y su transferencia es suficiente para posibilitar su transporte regional, nacional e incluso internacional. En este sentido, utilizando transferencias quirúrgicas se obtuvieron resultados aceptables de fertilidad (50-60 %) y prolificidad (5-8 lechones) tras el transporte transoceánico de los embriones (James y cols., 1980, Niemann y cols., 1989). Recientemente se ha demostrado que las mórulas o blastocistos tempranos conservados durante 24 h en un medio químicamente definido presentan elevadas calidad y supervivencia in vitro (Rubio Pomar y cols., 2004; Martínez y cols., 2014) e in vivo tras la transferencia no quirúrgica en la profundidad de un cuerno uterino (Martínez y cols., 2014). Además, ninguno de los embriones cultivados en los grupos experimentales eclosionaron durante el cultivo. Esto es de suma importancia por las razones sanitarias indicadas anteriormente (figura 7).

En la actualidad, nuestro grupo está evaluando la posibilidad de incrementar el tiempo de conservación de mórulas y blastocistos en estado líquido durante 72 h y los resultados preliminares son esperanzadores. Este sistema de conservación podría constituir una alternativa a la utilización de embriones vitrificados. Aunque no cabe duda de las innumerables ventajas de conservar los embriones durante un tiempo indefinido en nitrógeno líquido (N2L), el procedimiento no está exento de algunas desventajas como: (I) las estrictas normas del transporte aéreo de contenedores de N2L, reguladas por la International Air Transport Association (IATA, 2013); (II) el riesgo elevado de desvitrificación cuando se utilizan contenedores de nitrógeno seco durante el transporte aéreo; (y III) la necesidad en la granja de destino de disponer de tanques y N2L para realizar la manipulación de las pajuelas vitrificadas antes del calentamiento, lo cual no siempre es posible. Estos inconvenientes son los que han motivado la búsqueda de alternativas para conservar los embriones en ausencia de N2L durante un tiempo suficientemente largo desde su obtención en la granja de origen hasta su transferencia en la granja receptora.

Transferencia no quirúrgica con embriones vitrificados

Aunque la conservación en estado líquido puede permitir el transporte de los embriones desde la granja de origen hasta la receptora, y pese a los problemas señalados anteriormente, se prefiere la conservación embrionaria a largo plazo. Hasta el momento, la vitrificación es el único método eficiente para criopreservar los embriones de porcino. Los progresos efectuados durante los últimos 15 años han dado lugar a tasas elevadas de supervivencia in vitro después del calentamiento de los embriones porcinos vitrificados en el estadio de mórula (>80 %) y blastocisto (>90 %) sin ningún tipo de tratamiento previo (Martínez y cols., 2013a). A pesar de esos excelentes resultados in vitro, hay pocos estudios sobre la supervivencia in vivo de este tipo de embriones (Martínez y cols., 2016a), probablemente debido al esfuerzo y costes asociados con la obtención de un número elevado de embriones en esta especie. No obstante, los resultados publicados en alguno de esos estudios indican que con ese tipo de embriones es posible obtener una elevada fertilidad y prolificidad tras la transferencia quirúrgica de embriones vitrificados (Martínez y cols., 2013a, 2016a). Por lo tanto, el desarrollo de la transferencia no quirúrgica en combinación con la vitrificación embrionaria podría permitir la aplicación comercial de la TE en la industria porcina.

Desde un punto de vista práctico, nuestro laboratorio ha mejorado ambas tecnologías. Hemos demostrado que los embriones en estadio de mórula y blastocisto pueden ser vitrificados y calentados en un medio químicamente definido, usando acetato de polivinilo en vez de suero o derivados séricos, sin afectar al desarrollo embrionario in vitro o in vivo (Sánchez-Osorio y cols., 2010; Cuello y cols., 2016b). Por tanto, hoy se dispone de un medio totalmente definido para la recolección, manipulación, vitrificación, calentamiento y transferencia de los embriones, y este medio no requiere el uso de CO2. Todo ello simplifica la utilización de la tecnología de vitrificación, tanto en la granja donante como en la receptora. Por otra parte, también hemos simplificado el procedimiento convencional de calentamiento embrionario de tres etapas en un calentamiento directo (Cuello y cols., 2005, Gomis y cols., 2012), lo que facilita el uso de este tipo de embriones en la granja receptora.

En nuestros estudios preliminares de transferencia no quirúrgica con embriones vitrificados se obtuvieron aceptables tasas de parto (40-50 %) y número de lechones nacidos (5-10 lechones) (Cuello y cols., 2005; Gomis y cols., 2012). Recientemente hemos comparado la efectividad de la transferencia no quirúrgica de embriones vitrificados con un elevado número de receptoras, evaluando el efecto del número de embriones transferidos (Martínez y cols., 2015). Nuestros resultados indican que la transferencia no quirúrgica de embriones vitrificados puede ser tan efectiva como la transferencia quirúrgica con un número apropiado de embriones transferidos (fertilidad: 72 %; prolificidad: 9,9 lechones nacidos) y que la fertilidad y prolificidad de las receptoras aumentan del 40 % al 72 % y de 5,7 a 9,9 lechones, respectivamente, cuando se incrementa el número de embriones vitrificados por transferencia de 30 a 40 (figura 8).

Futuro reproductivo de las cerdas donantes y receptoras

En la actualidad el único sistema efectivo para la obtención de los embriones porcinos es el lavado de ambos cuernos uterinos tras el sacrificio de la hembra o mediante intervención quirúrgica. Debido a que las empresas de genética se cuestionan frecuentemente la reutilización de las cerdas donantes de elevado valor genético tras ser sometidas a una cirugía para la obtención de embriones, recientemente hemos evaluado el impacto de este procedimiento sobre el futuro reproductivo de dichas cerdas. Asimismo, hemos evaluado el futuro reproductivo de las cerdas receptoras tras la transferencia no quirúrgica de embriones, lo cual también es materia de interés para las granjas receptoras. Nuestros resultados indican que, aunque la obtención quirúrgica de los embriones no afectó a la tasa de partos subsiguiente (90,5 %), la prolificidad disminuyó severamente (8,9 ± 0,8 lechones) en comparación con aquella alcanzada antes de la cirugía (10,8 ± 0,3 lechones) y con la del grupo control (10,7 ± 0,3 lechones). En cambio, la transferencia no quirúrgica de los embriones no afectó a la fertilidad ni a la prolificidad de las cerdas receptoras en el ciclo siguiente, independientemente de que estas quedaran gestantes o no tras la transferencia (Martínez y cols., 2016b). Estos resultados indican que las cerdas receptoras pueden ser reintroducidas como reproductoras de la granja tras su utilización en un programa de TE por vía no quirúrgica. Por el contrario, es necesario perfeccionar el procedimiento quirúrgico de obtención de embriones para que las cerdas donantes puedan ser utilizadas como reproductoras después de las cirugías.

Conclusiones

En la actualidad existe una técnica simple y eficaz para transferir los embriones en la profundidad de un cuerno uterino de las cerdas receptoras por vía no quirúrgica. En los últimos años se han realizado importantes avances en la conservación de embriones porcinos, tanto en estado fresco como criopreservado. Los resultados reproductivos alcanzados mediante el uso combinado de ambas tecnologías (transferencia no quirúrgica y conservación embrionaria) indican que, por primera vez, la TE podría utilizarse en la especie porcina a nivel comercial con suficientes garantías de éxito. Ahora es el momento de trasladar la ciencia a la práctica; es el momento de que las empresas de genética entren en acción.

Agradecimientos
Muchos de los estudios descritos en esta revisión fueron financiados por el Centro para el Desarrollo Tecnológico e Industrial (CDTI-Selección Batallé SA: 20090686; CDTI-Agropor SA: IDI-20140140; CDTI-Porcisan SA: IDI-20140142), MICINN-FEDER (AGL2009-12091), MINECO-FEDER (AGL 2012-38621 y AGL201569735-R) y la Fundación Séneca de la Región de Murcia (19892/GERM/15).

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