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Perfumo L., Carlos J. (MV); Petruccelli L., Miguel Angel (MV) [1]; Massone B., Adriana (MV); Herrero Loyola, Miguel Angel. (MV); Echeverría A, Gabriela (MV) [2]
Docentes Instituto de Patología Dr. B. Epstein, Facultad de Ciencias Vetrinarias UNLP.
[1] Servicio Central de Microscopía Electrónica FCV.UNLP.
[2] Cátedra de Virología. FCV. UNLP

RESUMEN
 
El estudio histopatológico de 2 pulmones de cerdos de 80 kg de peso, con un cuadro macroscópico de pleuropneumonía y de los cuales se aisló actinobacillus pleuropneumaniae serotipo 1, reveló severa bronquitis y bronquiolitis fibrinonecrótica, vasculitis y perivasculitis, hallazgos éstos no relacionados con la bacteria aislada. Estudios con microscopía electrónica de epitelio bronquial y bronquiolar permitieron observar la presencia de partículas virales en el núcleo y citoplasma de las células epiteliales y cuya morfología y tamaño correspondían a virus herpes. Mediante la técnica de inmunohistoquímica complejo avidina-biotina (ABC) utilizando suero policlonal anti Suid Herpes Virus-1 (SHV-1), se comprobó reactividad positiva contra dicho virus en el epitelio ronquial/bronquiolar, conectivo peribronquial y perivascular y en macrófagos alveolares. A partir de estos hallazgos se hace necesario, de cuadros de pleuroneumonía, la búsqueda de agentes virales, en particular SHV-1 para determinar en nuestro medio el grado de prevalencia de esta asociación virus-bacteria.

INTRODUCCION
 
En las especies domésticas es bien conocido a nivel del aparato respiratorio la interacción virus bacteria, facilitando los primeros la colonización y ulterior infección por bacterias Gram negativas (Dungworth, 1985). En el cerdo ejemplos de dicha interacción son la infección por el virus de la peste porcina clásica (PPC) y Actinobacillus pleuropneumoniae (A.p) y/o Pasteurella multocida (P.m) (Costa y col., 1990; Perfumo, 1982), el virus de la Rinitis a Cuerpos de Inclusión y Pseudomonas aeruginosa (Perfumo y col., 1990) y el virus de la Enfermedad de Aujeszky (Suid Herpes Virus, SHV-1) con A.p y P.m (Ciprian Carrasco y Mendoza 1991; Iglesias y col., 1988; Lai y col., 1986). La infección por SHV-1 se manifiesta clínicamente en cerdos jóvenes por signos nerviosos, los que guardan relación con la meningoencefalitis difusa no supurativa y la ganglioneuritis que este virus produce (Ambroggi y col., 1981; Gustafson, 1981). En cerdos en engorde y terminación en condiciones de campo no se consignan signos nerviosos y sí manifestaciones de disfunción respiratoria debido a las lesiones producidas a nivel del epitelio de las vías aéreas (Gustafson, 1981; Iglesias y col., 1988; Narita y col., 1991; Pol y col., 1989), pared alveolar (Ambroggi y col., 1981; Baskerville, 1971; Gustafson, 1981) y macrófagos alveolares (Iglesias y col., 1988). Asimismo numerosos trabajos consignan en la infección por SHV-1, un aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas intercurrentes debido a la necrosis de las células linfoideas asociadas a bronquios y bronquiolos (BALT) y ganglios linfáticos regionales (Chinsakchai y Molitor, 1992; Lee y col., 1986). En los último años y en numerosos países (Ciprian Carrasco y Mendoza, 1991; Iglesias y col., 1988; Lai y col., 1986) se han descrito casos de campo en donde tanto desde el punto de vista epidemiológico como etiológico, confirman la interacción entre SHV-1 y A.p. Sin embargo, existe escasa información referente a las variaciones en los cambios anatomopatológicos observados en el tracto respiratorio cuando ambos agentes interactúan, objetivo éste del presente trabajo.

MATERIAL Y METODOS
 
Historia del caso

Se remitieron 2 cerdos de aproximadamente 80 kg de peso, provenientes de un criadero de engorde y terminación con una población susceptible de 800 animales. Los cerdos fueron comprados con un peso de 50-60 kg de 7 fuentes diferentes incluyendo una feria. A su arrivo al establecimiento, fueron desparasitados con ivermectina y vacunados contra PPC. La alimentación fue balanceado comercial adicionado de tilosina 110 ppm durante 10 días. Posterior a su ingreso se observaron cerdos con disnea, fiebre, estupor y muerte en goteo durante un período de 2 meses. Sin embargo, al momento de la remisión de las muestras, en un plazo de 2 días murieron 13 cerdos de igual peso que los estudiados.

Estudios anatomopatológicos

Se realizaron las necropsias completas de 2 cerdos y se tomaron muestras de pulmón para estudios anatomopatológicos. Las muestras se fijaron en formalina tamponada al 10%, se incluyeron en parafina y luego fueron teñidas con hematoxilina y eosina (HE) y hematoxilina ácido fosfotúngstico (PTAH). Para estudio mediante microscopía electrónica, muestras de bronquios y bronquiolos fijadas en formalina, se refijaron en glutaraldehido al 2-4% durante 2 horas. Con posterioridad se fijaron en tetróxido de osmio al 1%, se incluyeron en resinas epóxicas y se colorearon con acetato de uranilo y citrato de plomo. La observación se realizó con microscopio electrónico marca JEM 1200 EX II.

Para estudios inmunohistoquímicos se utilizó el método de avidina-biotina (ABC Vectastain Vector Lab. USA). Cortes de pulmón fijados en formol e incluidos en parafina fueron desparafinados bloqueándose la peroxidasa endógena; con posterioridad se incubaron con suero hiperinmune policlonal anti SHV-1 obtenido de conejos en diluciones 1:250, 1:500, 1:1000 y 1:2000 a 4ºC durante toda la noche. A posteriori las muestras se incubaron con suero hiperinmune anti IgG de conejo biotinilado a la dilución de trabajo indicada por el fabricante, incubándose luego con el complejo avidina-biotina peroxidasa y revelándose esta última con diaminobencidina. Como colorante de contraste se utilizó hematoxilina. Como control negativo se utilizó la misma muestra omitiéndose el suero anti SHV-1. Como control positivo se utilizaron muestras experimentales. La reactividad positiva se visualizó de coloración amarillo-marrón dentro de estructuras celulares o extracelulares.

Estudios bacteriológicos

Muestras de pulmón se sembraron en agar PPLO (Difco Laboratories) con extracto de levadura fresco al 10% y suero equino inactivado al 5%, incubándose a 37ºC por 18 h. De las colonias sospechosas se realizó coloración de Gram, dependencia con el factor V y serotipificación por el método de aglutinación en placa, con suero hiperinmune anti A.p. serotipos 1 y 5.

Estudios virológicos

Muestras de pulmón se inocularon en huevos embrionados de 9-11 días de edad vía cavidad alantoidea y en células de línea BHK y PK 15, realizándose 3 pasajes ciegos.
 

RESULTADOS Y DISCUSION
 
Estudios anatomopatológicos

En los 2 cerdos estudiados se observó un cuadro de pleuroneumonía y pericarditis fibrinosa. Los pulmones estaban consolidados, particularmente los lóbulos caudales, de color rojo oscuro y consistencia friable. Los ganglios linfáticos satélites estaban agrandados y edematosos. La observación microscópica reveló a nivel de las vías aéreas (bronquios y bronquiolos), necrosis y descamación de las células epiteliales y la presencia de exudado serofibrinoso e infiltrado celular inflamatorio que ocluía la luz bronquial/bronquiolor (Figura 1). En los alvéolos se observó exudado serofibrinoso en algunas áreas y en otras acúmulos de células mononucleares y leucocitos en degeneración, en particular a lo largo de los tabiques interlobulillares y rodeando el tejido conectivo peribronquial. En los capilares alveolares se comprobó masiva trombosis, al igual que en vasos de mediano calibre. En otros vasos, se comprobó necrosis de la íntima y media, infiltración celular inflamatoria en la pared y perivascular (Figura 2). El tejido conectivo interlobulillar, peribronquial y subpleural estaba distendido por exudado serofibrinoso al igual que los vasos linfáticos. Con microscopía electrónica, a nivel del núcleo de las células epiteliales de las vías aéreas, se observaron numerosas partículas virales, algunas incompletas, cuyo tamaño y morfología correspondían a virus herpes (Figura 3). En el citoplasma, las partículas virales se agruparon dentro de vesículas, recubiertas por una membrana (Figura 4).

Figura 1 - Bronquiolo
1. Necrosis del epitelio bronquiolar.
2. Exudado fibrinonecrótico que ocluye la luz. HE 20 X

Figura 2 - Vaso sanguíneo
1. Infiltración celular inflamatoria perivascular.
2. Necrosis de la pared alveolar HE 50 X

Figura 3 - Núcleo célula del epitelio bronquiolar
1. Se observan abundantes partículas virales, en su mayoría incompletas.
2. Virus revestido con membrana en el citoplasma.
Barra 0,5 µm

Figura 4 - Partículas virales en el citoplasma y espacio intercelular
Barra = 0,2 µm

Con la técnica de ABC, en dilución 1:1000/2000 se observó reactividad específica focal a nivel de las células epiteliales de las vías aéreas, tejido conectivo subyacente (Figura 5), macrófagos alveolares y en escasos vasos en tejido conectivo perivascular.

 
Figura 5 - Técnica de inmunohistoquímica ABC, contraste con hematoxilina 20%.
1. Reactividad positiva en células epiteliales.
2. Reactividad positiva en tejido conectivo peribronquiolar.
 

Estudios bacteriológicos

De pulmón se aisló en forma pura A.p. serotipo 1.

Estudios virológicos

Luego de 3 pasajes ciegos por huevos embrionados no se observó hemoaglutinación y en cultivos celulares no se comprobó citopatogenicidad ni se observaron cuerpos de inclusión.

DISCUSION

En nuestro medio es bien conocida la alta prevalencia de infección por A.p. particularmente en establecimientos de engorde que se proveen de numerosas fuentes (Costa y col., 1990; Perfumo y col., 1982; Perfumo, 1982; Vena y col., 1980).

Las lesiones producidas por A.p. son, tanto desde el punto de vista macro y microscópico, orientativas y en circunstancias patognómicas. La acción de las numerosas toxinas producidas por A.p. ejercen su efecto a nivel de todas las estructuras del pulmón. Así, los capilares de las paredes alveolares y los vasos de mediano calibre sufren por acción endotóxica a nivel del endotelio vascular y sobre los mecanismos intrínseco y extrínseco de la coagulación, trombosis y aumento de la permeabilidad (Perfumo, 1982). A pesar de la masiva trombosis, no es frecuente el hallazgo de vasculitis y perivasculitis como el descrito, hallazgo éste concordante con trabajos experimentales con SHV-1 en los cuales se observa vasculitis necrótica en vénulas, arteriolas y vasos linfáticos de los ganglios linfáticos submaxilares y tonsilas asociado con reactividad específica por técnica de inmunohistoquímica contra este virus (Narita y col., 1984). Mediante la técnica de ABC, se comprobó en algunos vasos sanguíneos de mediano calibre reacción positiva a antígeno SHV-1. Las diferentes citotoxinas de A.p. producen degeneración y necrosis de neutrófilos, monocitos, macrófagos alveolares y linfocitos T. Sin embargo a diferencia de otras bacterias Gram negativas A.p. no se adhiere o se adhiere pobremente a nivel del epitelio de las vías aéreas y por consiguiente tanto en condiciones de campo como experimentales no se observa bronquitis y/o bronquiolitis como la indicada en este estudio. Por el contrario, el SHV-1 produce necrosis de la pared bronquial y bronquiolar y necrosis de la pared alveolar (Ambroggi y col., 1981; B askerville, 1971; Gustafson, 1981; Iglesias y col., 1988). Estudios \\\"in vivo\\\" con cepas patógenas y cepas atenuadas, demuestran que las primeras producen alta mortalidad, necrosis focal generalizada en todos los órganos y encefalitis, mientras que las segundas producen sistemáticamente severa neumonitis (Narita y col., 1990). Estudios \\\"in vitro\\\" revelan que independientemente de su tropismo, a nivel del epitelio bronquial/bronquiolar ambas cepas producen necrosis (Narita y col., 1990), observándose con técnicas de inmunohistoquímica, que las cepas patógenas tienen la propiedad de atravesar la capa epitelial y multiplicarse en células mononucleares de la lámina propia y células conectivas (Pol y col., 1989), hallazgo similar al observado en el presente estudio. Se concluye que la observación de una bronquitis y/o bronquiolitis necrótica conjuntamente con vasculitis a partir de cuadros de pleuropneumonía del que se aísla A.p podría ser orientativo de una infección concomitante por SHV-1. A partir de estos hallazgos, se hace necesario el estudio virológico o inmunohistoquímico de cuadros de pleuroneumonía con el objeto de conocer el grado de difusión de esta asociación así como estudiar su patogénesis.
 

REFERENCIAS

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Fuente: Avances de Medicina Veterinaria, Vol.8, N°1, Enero - Junio, 1993

EJE CONCEPTUAL DEL ARTICULO
(Derechos reservados Portal Veterinaria.com)

Neumonía en cerdos de engorde: lesiones producidas por Actinobacillus Pleuropneumoniae y la enfermedad de Aujeszky*

En las especies domésticas es bien conocido a nivel del aparato respiratorio la interacción virus bacteria, facilitando los primeros la colonización y ulterior infección por bacterias Gram negativas. En el cerdo, ejemplos de dicha interacción son la infección por el virus de la peste porcina clásica. En el presente estudio utilizando microscopía electrónica de epitelio bronquial y bronquiolar permitieron observar la presencia de partículas virales en el núcleo y citoplasma de las células epiteliales y cuya morfología y tamaño correspondían a virus herpes.