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Congelación y vitrificación de embriones ovinos. Aspectos básicos y aplicados. Experiencias en Uruguay


En 1683 Boyle dio a conocer el primer trabajo sobre congelación, unos 250 años más tarde los trabajos de Belehradek y Luyet y Gehenio marcaron una época al dejar las bases para las teorías actuales (Diller y col., 1972). El descubrimiento de Polge y col., en 1949 que el glicerol protege los espermatozoides de la congelación fue seguido por el nacimiento de Frosty I en 1951; el primer ternero resultado del uso de semen congelado, iniciándose así el uso en inseminación artificial (Alta, 1994).

Luego se comenzó a congelar varios tipos de células, sin embargo en las décadas de los ’50 y ’60 muy pocos embriones sobrevivían la congelación. Whittingham y col. (1972) por un lado y Wilmut (1972a y b) por otro, comunicaron el nacimiento de los primeros mamíferos (ratón) provenientes de embriones congelados y conservados a -196°C. Willadsen y col. (1976a y b) fueron quienes lograron los primeros corderos de embriones congelados.

Desde el punto de vista práctico la principal ventaja de la congelación de embriones es que permite economizar y aumentar el rendimiento del uso de receptoras; aspecto que significa la mayor inversión en la industria de la transferencia de embriones.

Desde 1972 grandes avances se lograron en el estudio de muchos mecanismos involucrados en la sobrevivencia del embrión al congelamiento y descongelación, incluyendo curvas de enfriamiento, temperaturas de seeding e inmersión en nitrógeno líquido (N2L), tasas y temperaturas de descongelación, tipo, concentración y métodos de exposición a crioprotectores (Fahning y García, 1992), efectos tóxicos (Fahy, 1986) y protectores (Carpenter y Growe, 1988).

Años atrás se afirmaba que para tener éxito en la congelación de embriones se requería de un lento, preciso y controlado descenso de temperatura y lenta descongelación (Wilmut, 1972a y b). Willadsen y col. (1978a) demostraron que esto no era cierto.

Hoy es posible obtener embriones viables luego del descongelado utilizando nuevas técnicas, entre ellas la vitrificación, disminuyendo el tiempo de congelación desde varias horas a cerca de dos en congelación tradicional, poco más de una en congelación convencional y no mucho más de treinta minutos en vitrificación. Además de los clásicos crioprotectores glicerol y dimetilsulfóxido, actualmente se dispone de otros de variadas características, ritmos de enfriamiento cortos y descongelamiento rápido, buscándose métodos simples, económicos y rápidos para congelar embriones, especialmente en condiciones de terreno. La vitrificación es una clara demostración de lo anterior, con ventajas de ser muy práctica y económica.

Hoy el comercio internacional de embriones está establecido, y rutinariamente en muchos países del mundo se congelan embriones con fines comerciales con altas tasas de sobrevivencia. La congelación de embriones es indispensable tanto por razones económicas como científicas.

1. Congelación de embriones

1.1. Aspectos básicos

Los principios de la criobiología estudiados por muchos (Mazur, 1961a y b, 1963, 1965 y 1966; Leibo y Mazur, 1971; Meryman, 1971; Schneider y Mazur, 1984) han servido como base para el actual éxito y se aplican en la congelación de embriones mamíferos, aunque no del todo generalizables, ya que el embrión es una organización multicelular y su viabilidad depende tanto de la integridad celular como del estado de desarrollo.

La sobrevivencia del embrión a la congelación depende entre otros factores del tamaño de sus células, relación volumen superficie, permeabilidad al agua y el coeficiente de temperatura de dicha permeabilidad. Por eso, en una misma especie, características propias de un tipo celular o estado de desarrollo embrionario no puedan ser totalmente extrapoladas a otro tipo celular o estado de desarrollo embrionario; tampoco se pueden extrapolar totalmente características propias de un mismo tipo celular o estado de desarrollo embrionario pero de diferentes especies.

Se definirá como congelación tradicional y/o curva de enfriamiento (o congelamiento) tradicional al método basado en la menor formación de cristales de hielo intracelular con un enfriamiento a 0.3° - 0.6°C por minuto (°C/min) de -4.5° -7°C a los -30° -35 °C, con exposición de los embriones al crioprotector y remoción en una o más etapas. Se definirá como curva de congelación convencional y/o curva de enfriamiento (o congelamiento) convencional al método basado en la menor formación de cristales de hielo intracelular con un enfriamiento de 0.5° - 0.6°C/min desde -6° -7°C hasta los -30° -35°C, con exposición de los embriones al crioprotector y remoción del mismo en una etapa.

Los factores que producen lesión celular dependen de la temperatura, tiempo, velocidad del cambio de temperatura y el estado físico del agua (Mazur, 1966). El efecto solución y los cristales de hielo intracelular son los factores básicos implicados en el daño celular y a pesar que fueron descritos hace más de 30 años se siguen considerando para obtener altas tasas de sobrevivencia luego del descongelamiento.

Figura 1: Gráfica de temperatura de pajuelas de 0.25 ml conteniendo embriones durante su congelación. Arriba: Durante la congelación las pajuelas se mantienen a –7 ºC y se realiza el seeding. El aumento de temperatura subsiguiente es pequeño. Abajo: Si no se realiza el seeding las pajuelas llegan a mucho menor temperatura antes de la nucleación con el subsiguiente gran aumento de la temperatura. Adaptado de www.asymptote.co.uk.

La solución que está a temperatura inferior a su punto de congelación, fenómeno conocido como superenfriamiento (supercooling), debe liberar suficiente energía para cambiar de estado físico. Cuando sucede la cristalización espontánea (aproximadamente entre los -10° a -15°C), la energía acumulada se libera en forma de calor y la temperatura llega hasta el verdadero punto de congelación de la solución (aproximadamente de -4° a -7°C). Este brusco cambio de temperatura es letal para los embriones y para evitarlo se induce una cristalización en el medio extracelular a unos 2° a 4°C por debajo del punto de congelación del medio, es lo que se conoce por seeding (Figura 1).

El superenfriamiento del embrión a -6°C no afecta su sobrevivencia, pero por debajo de los -7°C disminuye abruptamente, el superenfriamiento por debajo de los -12°C es letal (Ciba, 1977).

Luego que se realiza el seeding los embriones deben permanecer a temperatura constante durante unos minutos para lograr equilibrio en la osmolaridad y temperatura intracelular.

Figura 2: Curvas de sobrevivencia de células según la velocidad de congelación. Las dos teorías descritas por Mazur y col (1972) para las causas de lesión celular al congelamiento.

Un importante concepto es que para diferentes tipos celulares existe una velocidad de enfriamiento óptima (curva crítica) que varía de acuerdo al tipo celular (Mazur y col., 1972)., su representación gráfica es una curva en forma de "U" invertida (Figura 2).

A velocidad de enfriamiento más rápida que la óptima hay formación de pequeños cristales de hielo intracelular (Figura 3), lo que se combina con recristalización en el descongelamiento (Mazyr, 1977b). El potencial químico del agua intracelular es mayor que el del agua y hielo extracelulares, entonces el agua tiende a fluir fuera de la célula y se congela externamente.

Si la congelación es muy rápida no saldrá suficiente agua de la célula y se congela dentro de ella formando cristales de hielo intracelular (Ciba 1977). La disminución de sobrevivencia debido al incremento en la velocidad de enfriamiento es una manifestación de lesión celular debido a la formación de cristales de hielo intracelular (Mazur y col., 1972)

Figura 3: Esquema de los eventos físicos ocurridos en el congelamiento. (hexágonos representan cristales de hielo de diferente tamaño según la velocidad de enfriamiento). Adaptado de Ciba, 1977.

A velocidad de enfriamiento más lenta que la óptima no habrá formación de cristales de hielo intracelular, el agua intracelular superenfriada fluye de la célula y se congela en forma de cristales de hielo grandes (Figura 3). Esto produce alteraciones en la composición y propiedades de las soluciones intra y extracelulares, proceso definido como efecto solución. Al congelar el agua extracelular los solutos se concentran y fluye agua de la célula para equilibrar el medio (Ciba, 1977) De continuar el proceso habrá hipertonicidad intracelular que causará lesión (Mazur, 1965 y 1966).

Para disminuir el efecto solución se detiene la deshidratación sumergiendo directamente la muestra en N2L.

Son varios los factores que producen lesión celular; fundamentalmente mecánicos o físicos y químicos o bioquímicos. La hipertonicidad causa desnaturalización proteica, disociación de lipoproteínas e influye en la activación, estabilización o inhibición de enzimas (Meryman, 1966).

Los cristales de hielo intracelular causan ruptura y vacuolización del citoplasma y membranas (Mazur, 1961a y b y 1966). La ruptura de membranas y en especial la de liposomas está asociada a la liberación de enzimas hidrofílicas liposomales con la consiguiente destrucción química de la célula (Meryman, 1966). Los cristales de hielo intracelular causan tanto alteraciones como ruptura mecánica de las membranas y deformaciones irreversibles con pérdida de función de las grandes moléculas orgánicas de la célula (Diller y col, 1972).

Otro mecanismo de lesión celular es el llamado fase de separación lateral de los lípidos de membrana, que causa modificaciones irreversibles en la estructura de la membrana celular y pérdida de su función (Ciba, 1977). Durante el enfriamiento lento el pH disminuye mucho, lo que está relacionado a desnaturalización proteica (Meryman, 1966).

Se puede simplificar que la congelación no es más que la remoción de agua pura de una solución y su aislamiento en forma de cristales de hielo; éste es el concepto más simple e importante. Todas las secuelas bioquímicas, anatómicas y fisiológicas de la congelación son directa o indirectamente consecuencia de este simple evento físico (Meryman, 1966); debe ser suficientemente rápido para evitar el efecto solución y suficientemente lento para que se forme la menor cantidad posible de cristales de hielo intracelular.

El embrión se coloca en un medio de congelación compuesto por crioprotectores, nutrientes y sustancias tampón, la mayoría se utilizan además para cultivos celulares o fecundación in vitro. La más utilizada es el Dulbecco fosfato buffer salino (PBS). El medio con el embrión debe mantenerse a un pH de 7.4 ± 0.5 y osmolaridad de 285 - 300 miliosmoles (mosm). El PBS tiene como sustancia tampón fosfato y su pH cambia muy poco en el medio ambiente, lo que no sucede con otros medios como TCM-199 y otros, que tienen tampón bicarbonato y pH no es controlado, se los debe mantener con alto nivel de CO2. Por lo anterior el PBS es el medio más usado, tanto en la solución crioprotectora como en el medio de recolección de embriones.

Al medio de congelación se le adiciona entre 10 % y 20 % de suero sanguíneo o 4 % de albúmina sérica bovina fracción V (BSA). También se ha usado suero fetal de ternero (FCS), de novillo, de ternero recién nacido o vaca dadora (Palasz y Del Campo, 1995), oveja (Willadsen y col., 1978a) o carnero con deferectomía (Ciba, 1977).

1.2. Aspectos aplicados

El embrión mantenido entre 18 y 20°C comienza a sufrir daño a las 5 - 8 horas (h) de recolectado (Willadsen y col., 1978a). En medios de cultivo a 37°C se logra sobrevivencia hasta unas 48 h (Willadsen y col., 1978a). Entre 0 y 5°C puede mantenerse de 24 a 96 h (Leibo y Winninger, 1986). Se ha comprobado que en estado superenfriado (supercooling) a temperatura entre -5°C y -15°C es posible mantener los embriones durante 24 - 72 h (Ramsbottom y col., 1993). Bajo los -130°C las reacciones biológicas son prácticamente nulas (Mazur, 1966). Mediante congelación y posterior conservación a -196°C en N2L se logran detener los procesos biológicos del embrión quedando en estado de animación suspendida, permitiendo que la congelación sea, en términos prácticos, indefinida (Palasz y Del Campo, 1995).

Según Seidel (1991), en los años ´50 los investigadores soñaban cuándo y cómo se podrían aplicar técnicas como la sincronización de estro y superovulación, sexaje de semen y embriones, maduración y fecundación in vitro, transferencia nuclear y la congelación de embriones. Actualmente estas técnicas ya están disponibles, y muchas se aplican a nivel comercial.

Se ha avanzado a tal punto que hoy es posible transferir un embrión descongelado de la misma manera que una común inseminación artificial, con gran seguridad y sin necesidad de previa evaluación.

La congelación de embriones permite que las ventajas que ofrece la tecnología de la transferencia de embriones aumenten significativamente.

Permite el comercio internacional de material genético de gran valor, pudiéndose transportar embriones congelados por mucho menor costo que el de animales en pie y con mucho menor riesgo de accidentes y transmisión de enfermedades. Exhaustivas revisiones sobre enfermedades transmisibles por semen y embriones (Guérin y col., 1997) concluyen que el riesgo de transmisión por medio de embriones es insignificante, siempre y cuando se sigan estrictas normas de manejo. El embrión es la forma más segura de mover material genético internacionalmente.

Ventajas adicionales al comercio internacional son la adaptación de la cría al medio ambiente de la receptora, no sólo en términos agroclimáticos, sino también debido al aporte de anticuerpos maternos durante la gestación y lactancia (Seidel 1991). También es posible cambiar totalmente la raza de un establecimiento o introducir nuevas razas en una región o país. A modo de ejemplo, en abril del 2000 la firma Albanell Hnos. realizó la primer importación al Uruguay de embriones ovinos de las razas Samm y Dorper, llevándose a cabo el primer programa comercial de multiovulación y trasferencia de embriones (MOET) aplicado a gran escala en Uruguay.

La congelación de embriones también permite conservar especies silvestres o poco comunes, en peligro de extinción o animales de gran valor genético que no pueden reproducirse por vejez, traumatismos u otros motivos.

Con respecto a actividad enzimática y crecimiento las células que sobreviven la congelación son genéticamente idénticas a la población original (Mazur, 1966). El potencial de aparición de mutaciones o enfermedades por otras causas es cientos de veces mayor que el máximo de 1/10000 que puede llegar a producir la congelación de embriones (Ciba, 1977). Este concepto, en la ciencia de la genética, permite conservar animales con mutaciones, consanguíneos o con combinaciones de genes especiales (Maurer, 1978) y protegerlos de enfermedades o accidentes.

Para estudios de selección natural y/o por razones de tipo comercial sería más conveniente la congelación de embriones que la de semen y ovocitos, ya que el embrión conserva el genoma completo diploide (Barros, 1985), pudiendo transferirse sin riesgos de cambio genético. La congelación de embriones permite acumularlos en gran cantidad para ser utilizados cuando sea necesario, ahorrando espacio y dinero, además de protegerlos de enfermedades o desastres naturales. Los embriones congelados se pueden mantener con seguridad mientras a sus parientes se les realizan pruebas de enfermedades; se pueden mantener en cuarentena mientras se examina el estado sanitario de la dadora, o unos se pueden transferir y otros congelar hasta analizar los registros de producción de la descendencia y evaluar mérito genético. Es posible descongelar un embrión, realizarle biopsia y volverlo a congelar mientras se descartan enfermedades genéticas.

Desde el punto de vista práctico, la ventaja más importante es la reducción de receptoras, haciendo más eficiente su uso, ya que representan la mayor inversión en la industria de la transferencia de embriones, aumentando la eficiencia del proceso ya que se pueden transferir embriones a medida que hay receptoras en un apropiado estado del ciclo estral. Esto significa disminución de costos y uso más eficiente del capital al aplicar menos hormona y necesitar menos horas hombre para el manejo de las receptoras. El mantenimiento de receptoras y su estado de salud son costosos y de principal importancia para el buen resultado de la transferencia de embriones.

1.3. Crioprotectores

Polge y col. (1949) descubrieron accidentalmente la acción del glicerol al comprobar que agregándolo al medio de congelación de semen ofrecía protección a los espermatozoides de gallo evaluado en términos de recuperación de la motilidad y capacidad fecundante luego de la descongelación. La presencia de crioprotectores es fundamental para la sobrevivencia del embrión congelado (Schneider y Mazur, 1984).

Cualquier célula de mamífero congelada sin crioprotector muere entre los -5°C y -20°C, con el agregado de crioprotectores disminuye progresivamente la temperatura letal hasta que la muerte celular ocurre aún por debajo de los -100°C (Ciba, 1977).

Los crioprotectores disminuyen el punto de fusión de las soluciones, reducen la concentración intra y extracelular de electrolitos y la excesiva deshidratación celular a temperaturas bajo cero (Ciba, 1977), reducen el hielo durante la congelación e influyen en su forma (Mazur, 1966). También inhiben la actividad de muchas enzimas disminuyendo o eliminando la actividad de radicales libres responsables de lisis celular, antes, durante y luego de la congelación y descongelación (Carpenter y Crowe, 1988), estabilizan proteínas celulares (Fahy y col., 1987), mantienen en equilibrio el potencial químico del agua intra y extracelular (Ciba, 1977), reemplazan las moléculas de agua removidas durante la congelación (Meryman, 1966) y bloquean la toxicidad de otros crioprotectores (Fahy y col., 1987).

Los crioprotectores no son panaceas y a pesar de sus varias funciones y características, la sobrevivencia embrionaria a la congelación difícilmente llega al 100 %, aún aplicando óptimas tasas de enfriamiento y descongelación (Fahy, 1986). Reducen el daño celular del efecto solución y cristales de hielo intra y extracelular, pero se debe considerar que tienen características tóxicas para las células.

Los crioprotectores pueden producir dos tipos de toxicidad, una directa o bioquímica y otra osmótica.

La toxicidad directa o bioquímica produce inactivación y/o desnaturalización proteica y enzimáticas, interfiere con bombas iónicas y solubiliza lípidos de membrana; toxicidad relacionada a interacciones entre crioprotector, proteínas y membranas (Fahy y col., 1987).

Los crioprotectores protegen la célula durante el enfriamiento al estabilizar proteínas, aunque paradojalmente, a temperaturas fisiológicas producen desnaturalización proteica porque la interacción crioprotector-proteína depende de la temperatura. Los crioprotectores poseen características hidrofóbicas e hidrofílicas, a baja temperatura las uniones hidrofóbicas son mínimas, predominando las hidrofílicas, el crioprotector queda excluido de la proteína y ésta mantiene su forma natural, a alta temperatura son favorecidas las uniones hidrofóbicas y el crioprotector se une a la proteína causando desnaturalización (Arakawa y col., 1990).

La toxicidad directa o bioquímica depende de la concentración del crioprotector, temperatura del sistema, presencia de otros crioprotectores o sustancias y de la hidrofobicidad relativa de la proteína (Fahy y col., 1987).

La toxicidad osmótica se debe a cambios de volumen experimentados por el embrión, que tiene un límite tolerable para su sobrevivencia (Ciba, 1977; Schneider y Mazur, 1984). Cierta proporción de agua es esencial para mantener y estabilizar proteínas celulares. La lesión de membrana está relacionada con el estrés osmótico, ya que toda célula tiene un mínimo tolerable de volumen (Meryman, 1971b).

Otra causa de lesión osmótica es que al existir excesiva deshidratación las proteínas celulares se concentran y disminuye el espacio citoplasmático, formándose fuertes uniones bisulfuro que no se separan cuando la concentración de agua se restablece. La formación de fuertes uniones bisulfuro altera la estructura proteica y produce su desnaturalización (Meryman, 1966).

Se debe destacar que muchas de las causas de lesión suceden durante el congelamiento y descongelamiento y no dependen exclusivamente del crioprotector.

Un buen crioprotector debe tener alta solubilidad y baja toxicidad a altas concentraciones y si es penetrante bajo peso molecular para entrar fácil y rápidamente a la célula y obtener el máximo efecto protector.

Comúnmente se utiliza el término permeable para referirse a un crioprotector que tiene la capacidad de entrar a la célula e impermeable o no permeable cuando no lo hace. Se piensa que el término permeable no sería correcto, ya que no es el crioprotector el que tiene esta característica, sino que la membrana celular es la que permite (de la interacción con el crioprotector) que entre o no a la célula. El término penetrante es el que mejor describe el comportamiento del crioprotector. Su acción puede considerarse como intracelular (penetrantes) o extracelular (no penetrantes).

Se han usado hasta la fecha unos 60 crioprotectores de muy variadas características. Se clasifican en dos grupos: a) Penetrantes de bajo peso molecular (glicerol y etilenglicol entre otros) y b) no penetrantes, de bajo (sucrosa y trehalosa entre otros) o alto (ficoll, polivinilpirrolidona y otros) peso molecular.

1.3.1. Crioprotectores penetrantes

La mayoría son alcoholes. Reemplazan osmóticamente el agua intracelular antes y durante el congelamiento y disminuyen el punto de congelación del agua, lo que combinado a una lenta tasa de enfriamiento disminuye la formación de cristales de hielo (Palasz y Del Campo, 1995). Sus pesos moleculares varían entre 32 y 212 Daltons.

1.3.2. Crioprotectores no penetrantes

Por el gran tamaño de su molécula no entran a la célula o lo hacen con extremada dificultad; son azúcares y macromoléculas. Reducen las fuerzas iónicas fuera de la célula e influyen en la formación de cristales de hielo (Palasz y Del Campo, 1995). Según el tamaño de la molécula se clasifican en bajo y alto peso molecular.

  1. Crioprotectores no penetrantes de bajo peso molecular. Son azúcares. Inducen deshidratación celular antes del enfriamiento, reduciendo la formación de cristales de hielo en la congelación (Palasz y Del Campo, 1995). Sus pesos moleculares son de 150 a 614 Daltons.

  2. Crioprotectores no penetrantes de alto peso molecular. Son macromoléculas. Protegen los embriones durante el congelamiento y descongelamiento alterando la formación de cristales de hielo intracelular a un tamaño y características tales que no producen daño celular (Palasz y Del Campo, 1995). Sus pesos moleculares son mayores a 1000 Daltons.

Para que los crioprotectores no penetrantes expresen al máximo sus características deben ser mezclados con crioprotectores penetrantes (Palasz y Del Campo, 1995).

El más usado ha sido el glicerol, aunque hoy en día se le ha prestado especial atención al etilenglicol (Voelkel y Hu, 1992; McGinnis y col., 1989 y 1993; Songsasen y col., 1993) que ha demostrado su efectividad en los trabajos más recientes (Martínez y col., 1997; Naitana y col., 1997). El etilenglicol, comparado con otros crioprotectores penetrantes, tiene ventajas por su alta velocidad de penetración y muy baja toxicidad a las células embrionarias (Tervit y Goold, 1984; Heyman y col., 1987; Cocero y col., 1988; Széll y col., 1989; Brebion y col., 1992; McGinnis y col., 1993; Songsasen y col., 1993). Según McGuinnis y col. (1993), el etilenglicol es el crioprotector más apropiado para congelar embriones ovinos de manera tradicional.

Se han usado gran diversidad de curvas de enfriamiento, temperaturas de seeding e inmersión en N2L, tasas y temperaturas de descongelación y tipo, concentración y métodos de agregado de crioprotectores. Pero independiente de la especie y método de congelación hay pasos comunes: a) Exposición del embrión al crioprotector; b) envasado; c) enfriamiento y congelación de temperatura ambiente hasta -196°C; d) conservación en N2L; e) descongelamiento de -196°C hasta temperatura ambiente y f) remoción (dilución) del crioprotector.

1.4. Exposición al crioprotector

Cuando se expone al crioprotector el embrión pierde agua y se encoge, el agua sale para equilibrar el medio. Luego de cierto tiempo el crioprotector comienza a penetrar en la célula y el embrión comienza a expandirse debido a la entrada de agua para mantener el equilibrio osmótico; se alcanza el volumen isotónico (equilibrio) cuando no hay más entrada de agua ni crioprotector (Leibo, 1989).

La penetración del crioprotector depende del coeficiente de permeabilidad, temperatura, concentración, de la superficie del embrión, especie y estado de desarrollo (Niemann, 1991). Lo anterior explicaría las diferencias en los resultados cuando se aplica un mismo método de congelación a embriones de diferentes especies, o cuando se usa un mismo crioprotector en diferentes estados de desarrollo embrionario.

La evolución con respecto a los crioprotectores utilizados y métodos de exposición del embrión a los mismos, buscándose ahorro de tiempo y facilidad, ha sido sorprendente.

Inicialmente se expuso el embrión al crioprotector a concentraciones molares decrecientes desde seis y luego a tres etapas. Del Campo y col. (1988b) concluyeron que no es necesario el lento y complicado proceso de adición del crioprotector en varias etapas (5 a 10 min cada una) al no haber diferencias entre ese método y adicionar el crioprotector en una sola etapa.

El embrión tiende a deteriorarse a medida que el proceso de congelación progresa, indicando que cada etapa tiende a causarle daño, para ahorrar tiempo y para que el método sea más práctico los embriones se exponen al crioprotector en una sola etapa ((Niemann, 1991).

Luego de la exposición al crioprotector, el embrión debe cargarse en un envase adecuado para comenzar con su enfriamiento (curva de congelación o enfriamiento).

Antes se usaban ampolletas de vidrio; desde 1984 el envase de elección es la pajuela de plástico de 0.25 ml (pajuela francesa), que tiene ventajas de diámetro muy pequeño, pared delgada, poco volumen y gran superficie de contacto, propiedades que resultan en un seeding más rápido y efectivo y en la disminución de la curva de enfriamiento crítica, implicando mayor sobrevivencia embrionaria (Niemann, 1991; Schiewe y col., 1991).

1.5. Curvas de enfriamiento (métodos de congelación)

De acuerdo a la velocidad de enfriamiento, concentración y tipo de crioprotector utilizado, hoy día hay disponibles varios métodos y variaciones para congelar embriones.

Los procedimientos que utilizan enfriamiento controlado requieren que se realice la inducción de formación de cristales de hielo (seeding), involucrando curva de enfriamiento, máquina congeladora, volumen de la muestra, el instrumento con que se realiza y su temperatura (Niemann, 1991) y el lugar donde se provoca. Generalmente el seeding se hace mediante el contacto con una pinza previamente enfriada en N2L.

Desde que separadamente Whittingham y col. (1972) y Wilmut (1972a y b) utilizaron una velocidad lenta de enfriamiento de 0.1° - 0.3°C/min desde la temperatura ambiente hasta los -60° a -80°C, se están haciendo modificaciones continuamente en las curvas de enfriamiento. La curva debe ser suficientemente lenta para prevenir formación de cristales de hielo intracelular y suficientemente rápida para minimizar la exposición de la célula al efecto solución.

Buscando que la congelación de embriones sea simple y rápida, se han usado distintas concentraciones y combinaciones de crioprotectores, agregados y extraídos en una o más etapas. Los embriones han sido congelados a diferentes velocidades, curvas de congelación y temperaturas de inmersión en N2L. Esto implica que sea difícil clasificar lo publicado. La confusión aumenta cuando se quieren clasificar en idioma español términos definidos en idioma inglés. Por ejemplo, quick, fast y rapid, que para el idioma español son sinónimos, no lo son para el idioma inglés. Se han publicado trabajos de congelación quick, que quedarían mejor definidos como congelación ultrarrápida, o two-step, quedando mejor definida como rápida. Algunos clasificaron la congelación one-step refiriéndose a la velocidad de enfriamiento; cuando actualmente la congelación one-step es conocida con respecto a la exposición de los embriones al crioprotector y transferencia del embrión descongelado sin necesidad de extraer el crioprotector.

Con la intención de aclarar la situación, en la presente revisión se clasifican los métodos de congelación de embriones (o curvas de congelación, o enfriamiento) de acuerdo al tipo de crioprotectores y concentración utilizada y la temperatura de inmersión en N2L. Se han clasificado en dos grandes grupos: a) curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rápidas (lenta, rápida con enfriamiento en dos etapas, rápida con enfriamiento en una etapa, muy rápida y convencional) y b) curvas de enfriamiento no tradicionales de dos etapas a ultrarrápidas (dos etapas, directa, ultrarrápida y vitrificación).

1.5.1. Curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rápidas

En estas curvas de enfriamiento (o congelación) se han usando crioprotectores penetrantes a concentraciones de 1.5 - 2.0 molar (M), variando la velocidad de enfriamiento (de 0.1° a 0.6°C/min) y la temperatura de inmersión en N2L (de -30°C a -120°C).

Figura 4 (pulse para agrandarla): Curvas de enfriamiento tradicionales lentas a muy rápidas. Nótese como a lo largo de los años el tiempo requerido para congelar embriones disminuyó desde aproximadamente 5h 20min en congelación lenta hasta no mucho más de una hora en congelación convencional.

  1. Congelación tradicional lenta. (Figura 4, curva amarilla). Con esta curva se logró por primera vez sobrevivencia de embriones mamíferos. El enfriamiento es lento, de 0.1° - 0.3°C/min de temperatura ambiente a los -60° a -120°C y luego inmersión en N2L; la descongelación se ha hecho de 4° a 25°C/min.
    El tiempo requerido para congelar los embriones es de unas 4.0 - 6.5 h. En embriones ovinos la sobrevivencia varía de 33.0 % - 80.0 % in vitro y 25.7 % - 44.4 % de preñez (Willadsen y col., 1974; Merry y col., 1984).

  2. Congelación tradicional rápida con enfriamiento en dos etapas. (Figura 4, curva verde). Willaden (Ciba, 1977) basado en trabajos con embriones ovinos y bovinos fue el primero en desarrollar una congelación rápida en embriones bovinos con enfriamiento lento en dos etapas (Willadsen y col., 1978a). La velocidad de enfriamiento fue de 1°C/min de temperatura ambiente a -7°C; permaneciendo 10 min (a los cinco min seeding), luego a 0.3°C/min hasta -30°C, después a 0.1°C/min hasta -36°C luego inmersión en N2L. Obtuvieron 76.2 % de sobrevivencia in vitro. Esta curva disminuye tanto el efecto solución como la formación de cristales de hielo intracelular, demostrando así que no es necesario llegar a los -60° o -80°C para sumergir los embriones en N2L. El tiempo requerido para congelar los embriones disminuyó a unas 3 h.
    En embriones ovinos la sobrevivencia ha variado entre 39.0 % - 93.0 % in vitro, 23.0 % - 64.0 % de preñez y 47.6 % - 85.0 % de nacimientos (Merry y col., 1984; Tervit y Goold, 1984; Martínez y col., 1993; Sakul y col., 1993).

  3. Congelación tradicional rápida con enfriamiento en una etapa. (Figura 4, curva azul). Lehn-Jensen y col. (1981) publicaron una congelación en dos etapas (two-step). Hoy quedaría mejor definida como congelación rápida con enfriamiento en una etapa. La curva de enfriamiento fue: de temperatura ambiente a -6° -7°C a 1°C/min, mantenimiento de la temperatura por 10 min, seeding, luego a 0.3°C/min hasta -30°, -35° o -40°C e inmersión en N2L. Cuando los embriones fueron sumergidos en N2L a -30°C hubo 63.0 % de sobrevivencia in vitro y 59.0 % de preñez. Con este método el tiempo requerido para congelar los embriones disminuyó aproximadamente a 2 h, aumentando considerablemente el aspecto práctico de la congelación de embriones.
    En embriones ovinos la sobrevivencia varía entre 0.0 % y 80.0 % in vitro y 20.0 % a 73.0 % de preñez (Ware y Boland, 1987; Schiewe y col., 1991; Shelton, 1992; McGinnis y col., 1993).

  4. Congelación tradicional muy rápida. (Figura 4, curva roja). Los embriones son colocados directamente desde -4° a -7°C (o luego de un enfriamiento a más de 2°C/min), se mantiene la temperatura por 10 min (a los cinco min seeding) y luego se aplica un enfriamiento a 0.3° - 0.4°C/min hasta -30° a -35°C y posterior inmersión en N2L. Así el tiempo requerido para congelar los embriones llegó a ser 1.5 h; simplificándose aún más la congelación de embriones.
    En embriones ovinos la sobrevivencia ha variado entre 23.3 % - 76.7 % in vitro, 44.4 % - 82.0 % de preñez y 0.0 % - 78.0 % nacimientos (Heyman y col., 1987; Cocero y col., 1988; Czllonkowska y col., 1991; Joly y col., 1992; Nellenschulte y Niemann, 1992).

  5. Congelación convencional. (Figura 4, curva negra). La aplican hoy casi todos. Los embriones se colocan directamente a -7°C, permanecen durante 10 min (a los cinco min seeding), y luego se hace un enfriamiento a 0.5° - 0.6°C/min hasta los -35°C; después se sumergen en N2L. El avance logrado con esta curva reduce el tiempo de congelación a no mucho más de una hora.
    En ovinos la sobrevivencia ha variado entre 53.3 % - 83.0 % in vitro, 22.7 % de preñez y 62.5 % de nacimientos (Songsasen y col., 1993 y 1995; Boggio Devincenzi, 1997 y 2001).

Entre las diferentes variaciones clasificadas, los porcentajes de sobrevivencia obtenidos han sido muy similares, lo que ha variado es la velocidad y temperatura final e inicial de congelación, llegándose a disminuir el tiempo de unas cinco horas inicialmente requerido a muy poco más de una hora. Esto ha significando un gran ahorro de tiempo y aumento en el aspecto práctico de la congelación de embriones, permitiendo que en muchos lugares se haga rutinariamente.

1.5.2. Curvas de enfriamiento no tradicionales

Se ha usado crioprotectores penetrantes de 1.5 a 8.0 M asociados o no a crioprotectores no penetrantes 0.25 y 2.0 M. Se han desarrollado otros métodos (2 etapas, directa, ultrarrápida, vitrificación) basados en disminuir la deshidratación celular durante el congelamiento antes de sumergir los embriones en N2L.

  1. Congelación en dos etapas. En embriones mamíferos la aplicaron Wood y Farrant (1980) con 1.5 M dimetilsulfóxido. Enfriaron los embriones hasta 0°C y colocaron ampolletas en baño de alcohol preenfriado a -9°C, mantuvieron la temperatura por 15 min y dos minutos después realizaron el seeding, posteriormente las transfirieron a otro baño de alcohol con temperatura constante de -20° o -25°C y se mantuvieron durante 10 a 30 min antes de ser sumergidas en N2L.

  2. Congelación directa. Bui-Xuan-Nguyen y col. (1984) desarrollaron un método muy rápido buscando una rápida deshidratación del embrión exponiéndolo durante unos minutos a una solución 1.0 - 2.0 M glicerol + 0.5 - 1.0 M sucrosa; produciendo. Antes de la inmersión en N2L los embriones permanecen 30 min a -30°C. La velocidad de enfriamiento fue de 12°C/min. Con este método obtuvieron 63.3 % de sobrevivencia in vitro y 33.3 % de preñez en embriones bovinos. Los resultados de sobrevivencia embrionaria logrados con esta curva son buenos, aunque últimamente no se han publicado muchos trabajos que hayan aplicado esta técnica.

  3. Congelación ultrarrápida. Se busca la deshidratación del embrión previa a su congelación, con la diferencia que luego de la exposición al crioprotector los embriones son sumergidos directamente en N2L o previamente expuestos durante unos segundos a vapores y luego sumergidos. No se necesitan sofisticados equipos de congelación, es muy práctica y no requiere de mucho tiempo. La congelación por este método es tan rápida que se forman cristales de hielo intracelular, pero tan peq

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