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Desarrollo de un método “abierto” para evaluar la calidad de la leche

La Federación Internacional de Lechería ha propuesto la normalización de una metodología fácilmente aplicable que permita detectar la eficacia de los tratamientos térmicos de la leche.


Este artículo aparece en el número 5 de la revista Hygia, que puedes leer íntegramente aquí.



Aurélie Dubois-Lozier
Science and Standards Programme Manager
International Dairy Federation AISBL

La leche es rica en muchos componentes alimenticios esenciales, como aminoácidos, lípidos, azúcar (en forma de lactosa), minerales y vitaminas. Sin embargo, esta riqueza también hace de la leche un medio fértil para el crecimiento de microorganismos, que pueden estropear la leche o presentar un riesgo de intoxicación alimentaria o de enfermedades de origen alimentario.

Los tratamientos térmicos de la leche son una de las prácticas más comunes que se llevan a cabo para inhibir el crecimiento microbiano. Es necesario disponer de procedimientos analíticos que permitan detectar la eficacia de los tratamientos térmicos. La mayoría de los métodos de referencia y oficiales para evaluar el tratamiento térmico de la leche se basan en la evaluación de las modificaciones de algunos componentes de la leche tras el proceso térmico, como la determinación de la actividad de las enzimas; concretamente la detección de fosfatasa alcalina activa residual en el producto.

Métodos de evaluación del tratamiento térmico

Medición de fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina activa residual se encuentra en las leches de todos los mamíferos y muestra variaciones en el nivel de las enzimas. Se utiliza universalmente como índice de la eficiencia de la pasteurización relámpago HTST (temperatura alta, tiempo corto). Esto se debe a que la fosfatasa alcalina está siempre presente en la leche cruda a niveles fácilmente mensurables y su perfil de estabilidad térmica sigue de cerca el requerido para una pasteurización adecuada.

La actividad de la fosfatasa alcalina en la leche se ha utilizado para demostrar la correcta pasteurización de la leche desde 1930. Se demostró que las condiciones de tiempo y temperatura necesarias para inactivarla eran ligeramente superiores a las requeridas para matar a Mycobacterium tuberculosis, el patógeno más resistente al calor en la leche cruda en ese momento.

Técnicas colorimétricas

A continuación se desarrollaron varias técnicas colorimétricas para la medición de la actividad de la fosfatasa alcalina, como el método colorimétrico de Scharer. Este utilizaba el sustrato fenilfosfato disódico mediante la medición del fenol liberado en una reacción de color secundaria con un reactivo.

Otros métodos de referencia son el de Aschaffenburg y Mullen utilizado en el Reino Unido, que empleaba el sustrato autoindicador p-nitrofenilfosfato con la posterior liberación de p-nitrofenol. Estos métodos históricos se utilizaron sobre una base semicuantitativa, en la que la actividad del fosfato de p-nitrofenilo se determinaba utilizando sistemas como la comparación con patrones de color y escalas de color ordinales o discos de comparación especialmente diseñados equivalentes a diferentes concentraciones de producto.

Método fluorimétrico

Hasta la fecha, el método más pertinente de que se dispone para la determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina en la leche es el método fluorimétrico descrito en la norma internacional ISO 11816-1|IDF 155-1, aunque tiene la desventaja de estar vinculado a un solo proveedor en lo que respecta al material y los reactivos.

Normalización de la metodología

Como parte de su mandato de promover enfoques con base científica e informados sobre cuestiones de inocuidad y calidad de los alimentos para asegurar que la inocuidad y la calidad de los productos lácteos mejoren continuamente, la Federación Internacional de Lechería (FIL), junto con la Organización Internacional de Normalización (ISO), ha propuesto la normalización de una metodología fácilmente aplicable en procesos prácticos con equipo de laboratorio estándar y no totalmente dependiente de un solo proveedor.

El principio del método fue descrito por primera vez por Fernely y Walker en 1965, para el análisis de la actividad de la fosfatasa alcalina purificada. Ziobro y McElroy aplicaron el método para los productos lácteos líquidos y, recientemente, el método fue desarrollado y validado por la experta la FIL Charlotte Egger, de Agroscope, Suiza, y por sus colegas y Hanène Ghezzal de la antigua EURL, ANSES, Francia. El proyecto tenía por objeto desarrollar un método abierto sensible para la evaluación de la actividad de los productos lácteos líquidos y sólidos que permitiera el análisis de múltiples muestras en paralelo.

Un nuevo método en desarrollo

El nuevo método, que se basa en la detección fluorimétrica, utiliza un lector de microplacas y reactivos fácilmente disponibles por la mayoría de proveedores de productos químicos. Esto constituye una ventaja fundamental con respecto a los métodos disponibles actualmente, y mejora aún más la capacidad del sector lechero para determinar si la leche y los productos lácteos han sido procesados térmicamente.

La metodología propuesta requiere que el usuario tenga acceso y pueda utilizar un lector de placas fluorimétricas y pueda utilizar con precisión una micropipeta. No se necesitan conocimientos especializados más allá de las simples técnicas de laboratorio. Este método es aplicable a:

  • Leche entera cruda y tratada térmicamente.
  • Leche semidesnatada.
  • Leche desnatada.
  • Nata.
  • Leches y quesos aromatizados.
  • Bebidas a base de leche de vaca, oveja y cabra.
  • Leche en polvo después de la reconstitución.

La metodología se basa en la desfosforilación del sustrato sintético de fosfatasa alcalina 4-metil-umbeliferil-fosfato. El sustrato se convierte en la 4-metil-umbeliferona (4-MU) altamente fluorescente que tiene una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. Las muestras líquidas pueden medirse sin necesidad de preparación y para las muestras sólidas se ha desarrollado un procedimiento de extracción.

El ensayo de la enzima cinética se realiza a 37 °C, con un pH de 9,8 durante 15 min. La actividad de la fosfatasa alcalina puede calcularse a partir de la parte lineal de la medición cinética utilizando una curva estándar con el producto fluorescente 4-MU en paralelo a las muestras desconocidas.

La actividad en las muestras sólidas U/g o líquidas mU/L se define como la liberación de 1 mmol de 4-MU por minuto. La repetibilidad relativa media del método fue del 7,6 %, establecida en dos ensayos interlaboratorios en cinco países diferentes. El límite inferior de detección es del 0,003 % de leche cruda en leche pasteurizada, lo que es comparable al método de referencia existente ISO 11816-1. Una comparación de métodos según Bland-Altmann, realizada entre la microplaca y el método de fosfatasa alcalina de referencia con 66 muestras de leche y 25 muestras de queso, respectivamente, mostró que las diferencias entre las actividades de fosfatasa alcalina obtenidas con los dos métodos se situaban en más del 95 % dentro del doble de las desviaciones estándar de la actividad media.

Se cree que el desarrollo de un método “abierto” para la detección de la fosfatasa alcalina en la leche y los productos lácteos proporcionará una detección fluorimétrica alternativa totalmente independiente y fácilmente aplicable en procesos prácticos con equipo de laboratorio estándar, y representa un importante paso adelante en la determinación del procesamiento térmico de la leche. Se prevé que el método revisado de las especificaciones técnicas de la ISO/IDF se publique en 2021.

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